‘由良’蜜橘成年态茎段培养及微芽嫁接方法的优化*

徐 严，谭李梅，骆夏辉，杨 亚，唐志敏，周 闰，蔡建国

（郴州市农业科学研究所，湖南省农业科学院郴州分院，423000）

‘由良’蜜橘为日本选育的品种，系‘宫川’特早熟芽变，2006 年引入国内试验研究[1]，在浙江省永嘉、宁海等地栽培表现良好，极具发展前景[2-3]。湖南省郴州市“东江湖蜜橘”为地理标志产品，是当地农民致富的支柱产业之一[4]。东江湖蜜橘主栽柑橘品种为‘宫川’，由于品种老化等问题导致效益降低，引进特早熟‘由良’蜜橘是提高“东江湖蜜橘”品质的有效途径。

长期无性繁殖及频繁的区域调运苗木使柑橘易感染病毒和类病毒病害，对柑橘产业造成严重损失且尚无有效的防治药剂。近年来，柑橘黄龙病的蔓延十分严重，培育和栽植无病毒苗木是防控黄龙病的关键措施之一。珠心苗培育和茎尖培养存在童期长、果实品质不稳定等问题，且柑橘成年态植株的茎尖难以直接诱导分化成完整植株。Murashige提出茎尖微芽嫁接技术，并证实可脱除柑橘病毒病。研究表明[5-6]，茎尖嫁接技术是目前脱除柑橘病毒和类病毒最有效的方法，可成功脱除黄龙病、衰退病、裂皮病等多种病害。

从田间直接采取柑橘茎尖受季节影响较大，茎段组织培养是获得茎尖的重要途径之一，但柑橘成年态茎段组培过程中污染率高、芽体增殖分化低等问题制约了相关技术的发展[7]。优化柑橘成年态茎段消毒和培养方法，对提高茎尖嫁接脱毒效率，为柑橘无病毒苗木繁育提供技术支撑具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的外植体采自郴州市农业科学研究所果树基地柑橘园，供试品种‘由良’蜜橘，砧木为枳，树龄3 年。茎尖微芽嫁接的砧木种子为保存在实验室的‘卡里佐’枳橙种子。

1.2 试验处理与方法

1.2.1 砧木种子处理和试管砧木培养

挑选饱满、无伤痕的种子，在室内用无菌水冲洗干净后，剥去外种皮并保湿，将种子倒入灭菌培养皿中。在超净工作台上加入75%酒精消毒30 s，再用1%NaClO 和吐温20 消毒20 min，然后用无菌水冲洗种子3 次。用3 种方式进行种子处理：剥除内种皮、划破内种皮、直接播种。处理完成后，用镊子轻轻夹住种子并送入装有MS 固体培养基的试管里，每管1～2 粒种子，放入27 ℃的恒温培养箱培养，14 d 后统计种子污染率和萌芽率。砧木长到10～15 cm 时，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 外植体采集

（1）单芽茎段的采集。2020 年6 月5 日（晴天）10：00，剪取无病虫害、半木质化枝条，装入洁净的塑料袋内带回实验室，将枝条上的叶片剪去，自来水冲洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再冲洗20 min，剪成2 cm 左右的单芽茎段，放入干净的培养瓶中用无菌水浸泡保湿。

（2）多芽茎段的采集。于6 月15 日（晴天）10：00，从培养室内剪取1 年生的无病虫害、半木质化枝条，装入洁净的塑料袋内带回实验室，将枝条上的叶片剪去，自来水冲洗后用1%洗衣粉溶液浸泡2 h，再冲洗20 min，剪成带有3 个腋芽的茎段，放入干净的培养瓶中用无菌水浸泡保湿。

（3）直接采取茎尖。于6 月25 日（晴天）10：00，采取长2～3 cm 的嫩芽（带2～3 片嫩叶），用湿润棉花进行保湿后带回实验室，在实验室内去除嫩叶，放入无菌培养皿中用无菌水保湿。

1.2.3 外植体消毒和培养

（1）单芽茎段的消毒。采用5 种方法对柑橘单芽茎段进行消毒处理，即方法A：采用1%NaClO消毒20 min→无菌水冲洗5 次；方法B：采用3%NaClO 消毒20 min→无菌水冲洗5 次；方法C：采用5%NaClO 消毒20 min→无菌水冲洗5 次；方法D：采用1%NaClO 消毒20 min→无菌水冲洗5次；方法E：用1%NaClO 消毒25 min→无菌水冲洗5 次。每种方法均先用75%酒精处理30 s，其中方法A、B、C 从田间采样，方法D、E 从培养室采样。

（2）多芽茎段的消毒。在超净工作台上进行消毒处理。先用75%酒精浸泡30 s，经无菌蒸馏水冲洗后，放入1%NaClO 中消毒20 min，最后用无菌水冲洗3～5 次。

（3）田间采集的茎尖消毒。在超净工作台上进行消毒处理。先用75%酒精浸泡30 s，经无菌蒸馏水冲洗后，放入0.3%NaClO 中消毒5 min，最后用无菌水冲洗3～5 次。

茎段消毒后放入MS 固体培养基中培养，培养基添加30.0 g/L 蔗糖和7.5 g/L 琼脂。培养条件：温度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。每处理3 次重复，培养15 d 后统计萌芽率、污染率等。

1.2.4 单芽茎段离体培养基配制及培养

不同单芽茎段的培养基均以MS 为基本培养基，附加6-BA（浓度0.5、1.0、1.5 mg/L）和IBA（浓度0、0.05、0.1 mg/L）的不同浓度组合，每个浓度组合培养20 个单芽茎段，重复3 次。30 d 后观察记载萌芽数量。培养条件：温度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h。

1.2.5 茎尖微芽嫁接及培养

在解剖镜下剥取含有2～4 个叶原基的茎尖嫁接于试管砧木苗上，放入MS 液体培养基中培养。培养条件：温度（26±1）℃，光暗周期16 h/8 h，光照强度为1 000～2 000 lx。每处理3 次重复，培养15 d 后统计腋芽数、出芽数、可用芽数，计算增殖倍数和利用率。

1.3 数据统计分析

试验数据采用Excel 2007 和SPSS 17.0 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式试管播种对砧木种子萌发的影响

由表1 可知，内种皮不同处理间的污染率具有显著性差异，内种皮剥除面积越大种子污染率越高，其中直接播种的污染率为17.5%，划破内种皮的污染率为32.5%，剥除内种皮的污染率达75.0%。剥除内种皮和划破内种皮的萌芽率均显著高于直接播种，为60.0%，直接播种的萌芽率仅为32.5%。由于最终目的是获得无污染的萌芽种子，故划破内种皮是砧木种子试管播种处理的理想方式。

表1 不同处理方式对砧木种子在14 d 萌发的影响

2.2 成年态茎段消毒方法的筛选

由表2 可知，不同消毒试剂、消毒时间及采样地点对‘由良’蜜橘成年态茎段的消毒效果均有影响。从田间采集的外植体中，NaClO 的浓度越高污染率越低，褐化率越高，且均具有显著差异。其中，1%NaClO 的污染率最高，为35.0%，褐化率最低，为45.0%；5%NaClO 的污染率最低，为5.0%，褐化率最高，为90.0%。试验中发现，成活的成年态茎段初期均可萌芽，但由于污染和褐化等原因导致后期无法继续生长，随着NaClO 浓度的升高萌芽率随之降低，其中1%NaClO 的萌芽率最高，为20.0%。

表2 不同消毒方法对‘由良’蜜橘成年态单芽茎段消毒效果的影响

为了提高消毒效果，增加萌芽率，将试材从田间转移至培养室培养，在培养室中抽梢，保持干净的培养环境，避免枝条感染过多真菌或细菌。试验结果表明，从培养室采集的成年态茎段用1%NaClO消毒时间为20 min 和25 min 的污染率一样，但褐化率降低。消毒20 min 的萌芽率达到70.0%，比从田间采样高50 个百分点，差异达显著水平（表2）。

综上所述，NaClO 浓度越高茎段污染率越低，褐化率越高，萌芽率越低，且从培养室采集的茎段污染率、褐化率都显著低于田间采集的，萌芽率显著高于田间采集的，即从培养室采集的成年态茎段用1%NaClO 消毒20 min 的消毒效果最好，污染率为20.0%，褐化率为10.0%，萌芽率达70.0%（表2）。

2.3 不同植物生长调节剂配比对茎段离体培养的影响

为了获得更多的茎尖数量，提高‘由良’蜜橘脱毒效率，以MS 为基本培养基，添加不同植物生长调节剂配比，分析不同培养基诱导单芽茎段的效果，并同时观察不同培养基条件下茎尖数量是否有差异。由表3 可以看出，6-BA 为0.5 mg/L、IBA 为0 时萌芽率最高，达95.5%，但增殖倍数最低；6-BA为1.0 mg/L、IBA 为0.05 mg/L 时萌芽率次之，为91.6%，但增殖倍数最大，达3.0。综合来看，6-BA为1.0 mg/L、IBA 为0.05 mg/L 时，对‘由良’单芽茎段离体培养的效果最好。

表3 不同植物生长调节剂配比对单芽茎段离体培养 的影响

2.4 茎尖来源对微芽嫁接增殖倍数和利用率的影响

在茎段培养的增殖过程中，单芽茎段多存在部分不定芽不具茎尖无法进行脱毒试验。单芽茎段和多芽茎段的不定芽的生长速度均不一致，反复拿出茎段取出茎尖的过程会增加污染率，导致后续得到的茎尖无法利用。因此，对不同茎尖来源的增殖倍数和利用率做了对比，其中，单芽茎段使用最佳培养基MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IBA 培养，多芽茎段使用MS 基本培养基培养。试验结果表明（表4），从培养室直接采取茎尖进行后续试验无法增殖，多芽茎段的不定芽再生增殖倍数为2.2，单芽茎段的不定芽再生增殖倍数最大，可达3.0，显著高于多芽茎段的不定芽。但多芽茎段不定芽利用率显著高于单芽茎段不定芽利用率，达81.8%。同时，在外植体数量相同的情况下，由于腋芽数量的差异会影响获得的可用芽数量，多芽茎段产生的不定芽数量显著高于单芽茎段。综上所述，使用多芽茎段产生不定芽的方式来获得茎尖进行脱毒试验的方法最优。

表4 茎尖来源对微芽嫁接增殖倍数和利用率的影响

3 讨论与结论

虽然利用成年态组织培养已经有一定的培养体系，但外部细菌、真菌和内生菌较多，导致污染率高和褐化率高的问题一直存在。利用脱除内外种皮的方法减少萌发阻力，是加快萌芽速度的有效方法。吴思梦等[8]研究表明，剥除内外种皮使用不同消毒方法的污染率最高为5.6%。本研究在实际操作过程中发现，在超净工作台上剥除内种皮需要较长时间，可能由于人为操作不当，污染率增加。从试验结果能看出，划破内种皮的方式可以大幅减少操作时间，降低污染率。陈国华等[9]发现，0.1%HgCl2消毒效果比10%NaClO 溶液好，最高成活率可达86.09%。由于升汞的安全系数不高，本研究还是采用NaClO 消毒，结果发现NaClO 浓度达到5%时，褐化率高达90.0%，萌芽率仅为5.0%，可能是由于采集的茎段成熟度不一致，与陈泽雄等[10]发现不同成熟度的材料消毒效果不同的研究结果相一致。很多研究表明，不同季节、不同天气取样会影响污染率[8,11]。本研究选择在晴天干燥的环境下取样，以降低污染率，但试验进程非常缓慢。考虑到田间环境微生物众多，故在培养室中直接培养原材料能控制环境条件，结果也表明在干净的环境条件下生长的外植体污染率均只有20.0%，且使用1%NaClO 消毒时培养室内生长的外植体较室外生长的外植体污染率显著降低。

将茎尖嫁接在无毒砧木上解决了发根难、生长慢等问题，应用十分广泛。由于田间采集接穗受季节、天气影响较大，多数研究者利用组织培养获得茎尖进行脱毒。前人多对茎段先进行初代培养再进行继代培养以获得茎尖，刘月[12]的研究结果表明，6-BA 的浓度越高，诱导率越高，但超过1.0 mg/L 时可能会导致愈伤组织增加、不定芽质量降低。本研究发现，诱导成功后侧芽会陆续冒出，可直接增殖来获得茎尖加快脱毒效率，但不同的植物生长调节剂水平下不定芽的粗壮程度不同。6-BA 浓度为1.0 mg/L、IBA 为0.05 mg/L 时，对‘由良’单芽茎段离体培养效果最好，萌芽率为91.6%，增殖倍数为3.0。

陈毅群等[13]、李丽[14]的研究表明，采集田间接穗进行微芽嫁接受季节影响较大，夏季萌发率最高，春秋季萌芽率显著低于夏季，利用诱导不定芽进行微芽嫁接的萌发率不受季节影响且显著高于田间芽。本试验通过培养室培养原材料，控制温湿度让植株处于最佳抽梢环境条件，也可避免接穗受季节影响导致萌发率不高的现象，但结果表明脱毒使用的茎尖在萌芽1 周左右采集脱毒效率最高，无法在短期内将植株上所有茎尖全部利用上，而通过茎段培养，可以分批次获取茎尖。试验结果表明，使用多芽茎段培养的不定芽利用率最高，达81.8%。

茎尖嫁接技术是目前使用最广泛的柑橘脱毒技术，此前多在茎尖大小、嫁接方法上研究以提高脱毒率，本研究主要利用组织培养获得茎尖，以打破季节限制加快脱毒效率。在前人基础上对种子、成年态茎段消毒方法和培养方法及茎尖来源进行研究，在一定程度上增加了获取茎尖的数量和质量。