将LAMP方法应用于《动物疫病防控》课程的教学改革探索

刘向楠，刘助红，刘贤旭，田存锋，康艳梅，刘国乾，李桂珍

（广东科贸职业学院 广州 510430）

《动物疫病防控》是一门综合应用性学科，具有较强的实践性和应用性。实验教学是《动物疫病防控》教学过程中的一个重要的必须环节，通过基本方法和技能培训，培养学生理论联系实际、发现问题及解决问题的综合能力。目前我国农业院校开设的《动物疫病防控》课程中在疫病实验室诊断方法部分普遍存在教学内容相对陈旧，实验内容落后等问题。例如，经典的细菌培养或病毒分离方法耗时长，主要适用于科研型实验室；荧光定量PCR等分子生物学检测方法近年来迅速发展和应用，但对仪器设备要求较高，在基层推广较为困难。为了学生能更好地学习《动物疫病防控》课程，从业后满足就业岗位的实际需要，本教学团队将环介导等温扩增（loop-mediatediso the rmalam plification，LAMP）技术添加到实训课程教学中，与学生共同探讨了该方法的技术优势及在临床应用的价值，得到了较好的效果。

LAMP技术是一种新型核酸扩增技术，其原理是采用4或6条能够识别目的基因上的6个特异区域的引物，依赖与Bst DNA聚合酶的强链置换活性，在65℃等温条件下30min就能扩增出约109～1010拷贝的靶序列。试剂盒内配备变色反应指示剂，可根据颜色变化判定实验结果。LAMP技术对核酸质量要求不高，可配合核酸免提取技术使用，现场即可完成检测，耗时短，无需昂贵仪器设备。目前，基于LAMP检测方法建立的非洲猪瘟检测试剂盒已获得新兽药证书，在兽医临床中得到广泛应用。故将环介导等温扩增技术应用到《动物疫病防控》能够让学生了解一线动物疫病实验室诊断新方法，为学生毕业后走向工作岗位打下一定的基础。

1 目前《动物疫病防控》课程教学过程中采用的实验室诊断方法

1.1 聚合酶链式反应法（PCR）

该方法是目前教学和实践中均广泛使用的方法。PCR方法发明至今已有将近30年的历史，技术非常成熟、配套试剂价格低廉、仪器设备价格也逐年降低，是实验室检测的主流方法之一，已具有替代传统分离鉴定法的趋势。但该方法在完成扩增程序后需要进行凝胶电泳，这一过程费时费力且在开盖过程中极易造成气溶胶污染，因此在临床一线实验室较少应用。

1.2 酶联免疫吸附实验（ELISA）

ELISA是免疫学诊断中常用的检测技术，已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病检测。本方法具有灵敏度高、特异性好、操作较为简单的特点，由于1d内可以同时检测几百上千份标本，因此在大型养殖企业中主要使用该技术方法评估疫苗免疫后的抗体水平。但是商品化的ELISA试剂盒主要以进口产品为主，成本较高，并且检测依赖于实验室，无法应用于现场检测。

1.3 血凝、血凝抑制实验（HA、HI）

血凝实验及血凝抑制实验是检测新城疫、禽流感等禽传染病的常用方法，也是检测家禽免疫抗体水平的常用方法。因其操作简便、快速、经济、无需仪器设备和可以对抗体水平进行量化的优点被广泛应用于基层饲养场。但该方法仅应用于特定的病原，绝大多数疫病不适用，1%红细胞悬液的制备需要新鲜配制和保存，结果判读主观性较强。

1.4 琼脂扩散实验

琼脂扩散实验主要原理是利用扩散原理，将可溶性抗原与抗体分别加入在半固体琼脂孔内，缓慢扩散，当抗原与抗体对应且比例适宜则形成白色沉淀线为阳性结果，否则为阴性结果。此方法非常经典，目前仍应用于马立克氏病等传染病检测。其缺点是需要过夜反应，耗时长，灵敏度欠佳。

2 LAMP检测方法的教学应用

在畜牧兽医领域LAMP技术最早大规模应用于水产病原微生物检测，未引起足够重视。伴随着基于LAMP技术的非洲猪瘟病毒检测试剂盒获得农业部的新兽药证书并在基层得到大量使用，LAMP技术已被普遍接受和认可。为了适应技术进步，紧跟发展趋势，作为畜牧兽医相关专业的学生有必要了解LAMP技术。

2.1 基本内容

本课程以实践应用为导向，教师结合案例带领学生分析猪塞内加谷病的流行病学特征、临床症状、病理变化以及设计LAMP方法的方案。

2.2 实验目的

①了解猪塞内加谷病毒的流行情况、致病性和预防措施；②掌握环介导等温扩增（LAMP）技术的原理及操作方法；③建立猪塞内加谷病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法。

2.3 实验原理

环介导等温扩增技术利用识别多区域特异性引物组和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右等温条件下30min即可扩增109～1010拷贝的靶序列。在反应体系中加入指示剂，可裸眼观察判断结果。

2.4 试剂与仪器

2×Lamp Master Mix购自哈尔滨新海基因检测有限公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；猪塞内加谷灭活病毒由广东省实验动物监测所提供；金属浴购自大龙兴创实验仪器（北京）股份有限公司。

2.5 实验方法

以猪塞内加谷病毒作为检测对象。

序列查找和引物设计：从Genbank上查找并下载猪塞内加谷灭活病毒VP1基因序列，将序列递交到在线网站http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.htm l自动生成多个LAMP引物组合，评分最高的引物序列委托上海生工合成。

核酸提取：按RNA提取试剂盒说明书提取灭活病毒中的RNA，测定RNA浓度和纯度。

按以下组分配置反应混合液，转入0.2mLPCR管中：

2×HNB Iso Amp Mix 12.5μL；

10×LAMPPrimerMix 2.5μL；

5M Beta in 2μL；

模板DNA 1μL；

Bst 2.0DNA Polymerase 1μL；

dd H2O补充至25μL。

Bst 2.0DNA Po lymerase 1μL；dd H2O补充至25μL。

将配置好的反应液充分混匀并瞬时离心，置于65℃金属浴中，30min后观察颜色变化。若扩增样本为阳性则由紫罗兰色变为天蓝色（图1）。

图1 猪塞内加谷病毒LAMP检测结果

2.6 实验教学效果

本实验内容涉及的病原为新发传染病，一般教材中未涉及该病原，需要老师课前与学生查阅相关参考文献了解猪塞内加谷病毒的背景信息。实操过程中按4～6人每组进行分组，鼓励组内分工协作，共同完成整个实验过程，组间进行平行实验来验证LAMP技术的稳定性。在结果判读结束后，教师提供非洲猪瘟、蓝耳病、伪狂犬等其他病原序列，供学生进一步演练引物设计环节。最终通过组内汇总分析实验结果完成实验报告。

本次从畜牧兽医行业实际需求出发，理论与实践相结合。在课前要求学生查阅文献资料了解猪塞内加谷病毒和LAMP技术相关知识，由学生自主设计引物锻炼了学生分析问题、解决问题的能力。在实验过程中，进一步巩固了核酸提取、反应体系配制等分子生物学相关技能，提高了学生的动手能力和团队协作能力。在课后的案例分析中，引导学生对临床案例进行分析讨论，举一反三，强化了科学分析能力并增强了学生自主学习的积极性。为后续专业课程的学习及日后就业打下了坚实的基础。

3 结语

目前《动物疫病防控》实训内容中的疫病实验室诊断侧重于PCR方法、ELISA法和HA/HI实验进行动物疫病诊断，而临床上已经出现了一些新检测技术，LAMP技术在临床应用广泛，将其应用于《动物疫病防控》课程，可以为学生提供一个相对真实的动物疫病诊断环境，将理论和实践结合起来，对学生的应变能力和技能熟练度要求较高，提高实践动手能力，在实验中考察学生检测技能，从而提高学生的学习效率和教习效果。█