华蟾素对Wnt/β-catenin通路抑制肾癌细胞增殖及侵袭的影响*

吴潇芸,郑盛锋,张明津,付伟金△

1广西卫生职业技术学院(广西南宁 530023)；2广西医科大学第一附属医院泌尿外科(广西南宁 530022)

华蟾素(bufalin)是传统中药蟾蜍皮肤中提取的有效成分，是一种类地高辛类物质[1]。研究证实华蟾素可促进胃癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖及细胞侵袭性，发挥抗肿瘤活性[2-4]。近年发现华蟾素不仅抑制泌尿系肿瘤中如膀胱癌、前列腺癌细胞增殖[5-6]，还可抑制肾癌细胞增殖和侵袭[7]，但具体机制仍有待进一步研究。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路已被证实与肿瘤细胞的增殖和侵袭密切相关。Gai等[8]证实华蟾素可下调Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达，从而抑制肝癌细胞侵袭和迁移。目前不清楚华蟾素抑制肾癌细胞增殖和侵袭，是否与调控Wnt /β-catenin信号通路相关蛋白表达有关。本研究开展于2019年1—12月，拟探讨华蟾素抑制肾癌细胞侵袭和增殖可能相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾癌细胞786-0购自上海中国科学院细胞库；华蟾素购自美国Invitrogen公司，RPMI 1640 细胞培养液、10%胎牛血清购自杭州四季青公司；单克隆抗体Wnt购自美国cell signaling公司；β-catenin(ab32572)，E-cadherin(ab1416)，N-cadherin(ab76011)，Vimentin(ab92547)，内参GAPDH购自英国Abcam公司；流式细胞试剂盒，CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养 肾癌786-0细胞在5%CO2、37℃培养箱中，RPMI1640培养液中培养，将处于对数生长期的肾癌细胞用于实验，华蟾素组添加华蟾素；对照组添加等量的PBS。本细胞实验经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理号：2017-KY-102)。

1.3 细胞增殖实验 取处于对数生长期的肾癌细胞，调整浓度为5×103·mL-1，置于96孔板培养，用不同浓度的华蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)添加于肾癌细胞，分别于培养24、48、72 h后将10 μL CCK-8试剂添加各组肾癌细胞中，37℃细胞培养箱共培养1 h，多功能扫描自动阅读仪检测吸光度(OD)值，各组实验重复3次。

1.4 细胞侵袭实验 华蟾素添加于肾癌细胞48 h后，加入无血清培养基，在Transwell上室及下室分别加入浓度为5×104·mL-1的细胞悬液和含10%胎牛血清的培养液；培养48 h后，将样本进行PBS洗涤，95%酒精固定，0.1%结晶紫染色。每组选取至少4个随机视野计数穿出细胞观察照相(200×)，各组实验重复3次。

1.5 细胞划痕实验 华蟾素添加于肾癌细胞48 h后，将肾癌细胞移到6孔板培养，当每孔铺满90%细胞时，用200 μL加样枪头，进行划痕损伤，每孔划痕1次，48 h后，使用倒置显微镜，随机选5个区域划痕面进行拍照 (×100)，根据细胞间距计算迁移率。实验至少重复3次。

1.6 流式细胞实验 将肾癌细胞2×105·mL-1接种在6孔板中，华蟾素添加于肾癌细胞48 h后。PBS洗涤细胞2次，取100 μL细胞悬液(加入1×Binding Buffer结合缓冲液制成1×106细胞/mL的悬液)。加入AnnexinV与核酸染料各1 μL后轻轻混匀，室温避光处放置15 min。再加入1×Binding Buffer 结合缓冲液80 μL 1 h内上机检测细胞凋亡。胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。PBS清洗细胞，离心去除PBS，加入70%乙醇，4℃冰浴过夜。1 000 r/min×5 min，弃去固定液，PBS清洗细胞2次。用1 mL PI染液重悬细胞，4℃避光30 min，上机检测细胞周期。重复实验3次。

1.7 免疫蛋白印迹(Western blot)实验 华蟾素添加于肾癌细胞48 h后，提取各组细胞总蛋白，每孔上40 μg蛋白进行SDS-PAGE后转至PVDF膜，封闭后添加一抗(Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin浓度分别为1∶300、1∶500、1∶50、1∶5 000、1∶1 000)，4℃过夜。洗涤后加二抗室温孵育2 h，洗涤，DAB显色，成像，GAPDH作为内参，实验重复3次。

2 结果

2.1 华蟾素可抑制肾癌细胞增殖 CCK-8实验显示，不同浓度华蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)作用于肾癌细胞24、48、72 h后，随着浓度增加，肾癌细胞增殖率显著下降(图1)，呈剂量和时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。华蟾素剂量(10～100 nmol/L)都有抑制作用，而到了200 nmol/L，细胞增殖明显下降，随后的实验使用100 nmol/L浓度的华蟾素，因为它对抑制肾癌细胞增殖最有效。

注：*与对照组比较P<0.05图1 华蟾素对肾癌细胞增殖力的影响

2.2 华蟾素可抑制肾癌细胞侵袭 Transwell实验结果表明，与对照组(344±35.56)个/视野细胞相比，华蟾素组(207±10.12)个/视野细胞明显减少(P<0.05)，见图2、表1。

2.3 华蟾素可抑制肾癌细胞迁移 细胞划痕实验结果表明，与对照组相比，华蟾素组肾癌细胞迁移率下降,组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表1。

表1 华蟾素对肾癌细胞侵袭和迁移能力的影响

2.4 华蟾素可促进肾癌细胞凋亡和阻滞细胞周期 流式细胞实验结果提示，与对照组相比，华蟾素组肾癌细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组G1、S细胞周期与华蟾素组比较差异无统计学意义(P>0.05)，G2/M细胞周期与华蟾素组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表2。

表2 华蟾素对肾癌细胞凋亡和细胞周期的影响

注：A：对照组；B:华蟾素组图2 华蟾素对肾癌细胞侵袭力的影响(光镜，×100)

注：A:流式细胞检测各组肾癌细胞凋亡；B:流式细胞检测各组肾癌细胞周期情况图4 华蟾素对肾癌细胞凋亡和细胞周期的影响

2.5 华蟾素对Wnt/β-catenin和上皮间质变(EMT)的影响 与对照组相比，华蟾素组中Wnt、β-catenin蛋白表达下调 (P<0.05)，同时EMT信号通路E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白表达下调(P<0.05)，见图5～6、表3。

表3 华蟾素对相关表达蛋白的影响

图5 Western blot 检测Wnt和β-catenin蛋白表达

3 讨论

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统常见恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的3%[9]。2020年美国预计新诊断RCC患者63 920例，13 680例患者死亡[10]。早期或局限性RCC患者可通过手术获得治愈，晚期或转移期RCC患者预后不佳，5年总生存率(OS)<10%，明确RCC侵袭及转移机制对于提高患者OS至关重要。

研究已证实华蟾素可抑制泌尿系肿瘤细胞如前列腺癌、膀胱癌等的增殖和侵袭，但对华蟾素对肾癌细胞的相关研究少见。与Xie等[7]研究结果相似，本研究使用不同浓度的华蟾素作用于肾癌细胞后，可抑制肾癌细胞增殖，以100 nmol/L浓度抑制效率最佳。Transwell侵袭试验和细胞迁移证实，华蟾素可抑制肾癌细胞细胞侵袭和迁移的能力。流式细胞学实验表明华蟾素可促进肾癌细胞凋亡，阻滞肾癌细胞周期，以上研究结果提示，华蟾素抑制肾癌细胞增殖可能与促进细胞凋亡增加有关。

Xie等[7]研究发现华蟾素可调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制肾癌细胞的增殖和侵袭，提示调控肿瘤细胞信号通路可能是治疗RCC的有效策略。但肿瘤的发生及发展非常复杂，可能涉及多个信号通路。Wnt/β-catenin是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号通路，包括Wnt蛋白家族、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、APC、Axin、β-连环蛋白(β-catenin)等多个关键蛋白，该信号通路已证实与恶性肿瘤的发生，发展，转移和不良预后有关[11-13]，该信号通路增强后可与细胞膜受体结合，并将信号传递给β-catenin，蓄积的β-catenin可进一步发挥调控通路下游蛋白和靶基因功能,并可影响EMT[14]。

EMT与肿瘤细胞包括肾癌细胞的侵袭和转移密切相关[15]。肿瘤细胞发生EMT时，上皮细胞标记物如E-cadherin下调，而间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin上调，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[16-17]。目前不清楚华蟾素抑制肾癌细胞增殖和侵袭是否与调控Wnt /β-catenin通路后、影响EMT相关蛋白表达有关。

本研究实验结果表明，华蟾素作用于肾癌细胞后，下调Wnt /β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt和β-catenin表达，上调E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达，逆转EMT。本研究推测华蟾素作用肾癌细胞后，可调控Wnt /β-catenin信号通路，导致该通路重要蛋白Wnt和β-catenin表达下调后，对肾癌细胞EMT起抑制作用，从而降低肾癌细胞侵袭及迁移力，这可能是华蟾素抑制肾癌细胞迁移和侵袭的机制。

综上所述，本研究推测华蟾素可能通过抑制肾癌细胞中的Wnt /β-catenin信号通路中重要蛋白Wnt、β-catenin表达后，逆转EMT，表现为E-cadherin上调，N-cadherin、Vimentin表达下调，进而抑制肾癌细胞增殖和侵袭，提示华蟾素有可能成为治疗RCC的新策略。但肾癌细胞的侵袭力及EMT的调控可能涉及多个信号通路及上游信号分子，因此仍需要进一步研究明确华蟾素调控肾癌细胞侵袭及EMT的具体机制。