肝细胞癌组织中PREX2的表达及其与患者预后的关系

王亚敏 郑 扬 陈旭峰 向正国

肝细胞癌(HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和病死率均较高[1]。HCC的恶性程度较高，大多数患者在就诊时已发生远端转移，错过了最佳治疗时机，导致患者的预后较差[2-4]。近年来，随着HCC诊疗技术的发展，HCC预后有一定改善，但患者5年生存率仍较低，约为26%[5]。因此，进一步探究HCC的发病机制，寻找效能较高的生物标志物以评估患者预后，对于改善HCC的预后情况具有重要意义[6]。

磷脂酰肌醇-3, 4, 5-三磷酸依赖性Rac交换子2(PREX2)是一种鸟氨酸交换因子，可表达于大多数恶性肿瘤中，如脑胶质瘤[7]、黑色素瘤[8]、非小细胞肺癌[9]、胰腺癌[10]等。近年来研究发现，PREX2在HCC组织中表达上调，且参与了HCC细胞的增殖和迁移过程[11]。本文探究了PREX2与HCC患者预后的关系，以期为改善HCC患者的预后情况提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2012年2月至2015年5月在中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院就诊的104例HCC患者作为研究对象。参照《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[3]诊断HCC。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)Child-Pugh分级为A级或B级；(3)能够配合完成相应的检查和随访；(4)HCC组织标本(活体组织病理检查时获取)保存完好。排除标准：(1)预计生存时间短于3个月；(2)HCC复发患者；(3)随访失联；(4)合并其他恶性肿瘤。104例HCC患者中，男性63例，女性41例，年龄38～70岁，平均年龄为(61.82±6.61)岁。本研究所有受试者均签署了知情同意书，且本研究经医院医学伦理委员会批准(批件号：201205052)。

1.2 信息收集

收集所有受试者的年龄、性别、Child-Pugh分级、乙肝表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤分期、肿瘤数量、肿瘤直径及治疗方案等临床资料。随访起始时间为确诊时间，采用复诊和电话随访的方式了解HCC患者预后生存情况，每3个月随访1次，为期5年，随访截至2020年5月28日或患者死亡。

1.3 HCC组织中PREX2水平检测

采用蛋白质印迹法检测HCC组织中PREX2的蛋白表达水平。具体步骤：(1)无菌环境下研磨HCC组织，滴加RIPA裂解液提取组织中总蛋白；(2)采用BCA法检测蛋白浓度；(3)配制10% SDS-PAGE分离胶，每孔30 μg总蛋白上样；(4)120 V电压下电泳，直至溴酚蓝跑出胶面；(5)300 mA电流下转膜2 h，然后用5%脱脂牛奶室温封闭1 h；(6)滴加一抗，4 ℃孵育过夜，滴加二抗，室温下孵育1 h；(7)TBS缓冲液洗膜，使用ELC发光液显影。应用ImageJ软件读取实验结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 生存组和死亡组PREX2的表达水平比较

104例HCC患者在随访期间有42例(40.38%)发生死亡。根据HCC患者的预后生存情况将其分为死亡组(n=42)和生存组(n=62)。死亡组PREX2蛋白的相对表达量为0.60±0.12，高于生存组(0.42±0.07)，两组差异有统计学意义(t=9.313，P<0.001)，见图1。

图1 两组PREX2的表达水平比较 A 生存组 B 死亡组

2.2 两组生存情况的比较

PREX2预测HCC患者预后的ROC曲线下面积(AUC)、最大约登指数、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.915(95%CI：0.843～0.960)、0.729、0.49、80.95%和91.94%，见图2。根据PREX2预测HCC患者预后的最佳截断值将其分为低表达PREX2组(n=65)和高表达PREX2组(n=39)。低表达PREX2组的中位生存时间为60个月，长于高表达PREX2组(25个月)，两组差异有统计学意义(log-rankχ2=72.646，P<0.001)，见图3。

图2 PREX2预测HCC患者预后的ROC曲线

图3 低表达PREX2组和高表达PREX2组的生存曲线

2.3 影响HCC患者预后的相关因素

将可能与HCC患者预后生存有关的因素，如年龄、性别、Child-Pugh分级、HBsAg、AFP、肿瘤数量、肿瘤直径、肿瘤分期、治疗方案和PREX2作为自变量，将HCC患者的预后生存情况作为因变量，纳入Cox单因素回归分析，结果显示年龄、Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤分期和PREX2与HCC患者预后生存有关(P<0.05)。将年龄、Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤分期和PREX2作为自变量，将HCC患者的预后情况作为因变量，纳入Cox多因素回归分析，结果显示年龄、Child-Pugh分级、肿瘤分期和PREX2均是HCC患者预后生存的独立危险因素(P均<0.05)，见表1。

表1 影响HCC患者预后的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

2.4 PREX2与HCC患者预后生存的关系

采用限制性立方样条拟合Cox比例风险回归模型分析PREX2与HCC患者预后生存的关系。当节点个数为3时，AIC值最小(AIC=309.521)。结果显示，PREX2与HCC患者的预后生存有关(χ2=43.86，P<0.001)，且呈非线性关系(χ2=4.54，P=0.033)。以PREX2预测HCC患者预后生存的最佳截断值作为分界点，当PREX2<0.49时，HCC患者预后发生死亡的风险降低；当PREX2>0.49时，HCC患者预后发生死亡的风险升高，见图4。

图4 PREX2与HCC患者预后的限制性立方样条图

3 讨论

近年来有多项研究指出，PREX2可参与HCC的发病及进展过程[11]，但有关其与HCC患者预后关系的报道较少。本研究比较了生存组与死亡组PREX2蛋白的表达水平，结果发现死亡组PREX2蛋白水平高于生存组，这提示PREX2可能与HCC患者的预后生存有关。

本研究结果表明，PREX2预测HCC患者预后生存的效能较高，检测其水平有助于临床医师及时了解患者的预后情况，从而制定有针对性的治疗方案。HCC患者的年龄、Child-Pugh分级和肿瘤分期与预后关系密切。范维等[12]研究表明，年龄较大、肿瘤分期为Ⅲ～Ⅳ期是HCC患者预后不良的独立危险因素。贾春丽等[13]研究表明，HCC患者的年龄、Child-Pugh分级和肿瘤分期均是预后的独立危险因素。本研究Cox比例风险回归模型分析结果显示，年龄、Child-Pugh分级和肿瘤分期均是HCC患者预后的独立危险因素，与上述研究结果相符。此外，本研究结果还显示PREX2亦是HCC患者预后的独立危险因素。Yang等[14]研究显示，HCC患者中PREX2的表达水平较高，且在68例HCC患者中检测到有16例患者至少携带一种PREX2基因突变，该研究表明PREX2基因突变可导致蛋白质变性，促进细胞增殖，从而促进HCC进展。Li等[15]研究表明，PREX2蛋白在54.9%的人类 HCC样本中表达上调，且其表达水平越高提示患者生存率越低；同时，该研究表明甘氨酸 N-甲基转移酶可通过促进PREX2的降解，参与蛋白激酶B信号转导通路表达和HCC的发生。体外研究证实，敲低PREX2的表达可降低HCC细胞的侵袭能力[16-17]。上述研究结果均表明，PREX2在HCC组织中表达水平较高，可促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，进而影响患者的预后。

综上所述，HCC组织中PREX2的表达水平与患者的预后有关，其表达水平越高提示患者的生存率越低。因此，检测HCC组织中PREX2的表达水平有助于评估患者的预后情况。本研究尚存在一定不足，如样本量偏小，且是单中心研究，致使实验结果可能存在一定选择偏倚。今后，本课题组将进一步探究PREX2影响HCC患者预后的病理、生理机制，为HCC治疗靶点的选择提供参考。