基于旷场实验探究二十味沉香丸对卒中后PTSD模型大鼠的调节作用*

李姝蒙，刘忠瀚，殷晓辉，俞 邦，朱泠霏，武慧超，毛 萌△

1北京中医药大学，北京100029;2首都医科大学附属北京中医医院

脑卒中（cerebral stroke，CS）是由脑血管破裂或阻塞，导致局部神经组织损伤而引发神经功能障碍的一类疾病。该病通常包括脑出血、脑梗死、蛛网膜下腔出血等在内，具有高死亡率、高发病率、高复发率及高致残率等特点［1］。创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder，PTSD）是经历异乎寻常的灾难性心理创伤事件（如严重车祸、战争、地震等），继发出现的一种普遍性与复杂性的精神类疾病［2］。其主要症状包括创伤事件的再体验、回避反应及高警觉状态等［3］。脑卒中本身对患者生活及心理造成巨大影响，并具有不可预见的特点，足以成为引起PTSD的内在应激原，引发患者出现与寻常PTSD十分类似的临床表现。前期研究显示，脑中动脉线栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模后动物出现了一定的PTSD状态［4］。所以项目组在MCAO造模后筛选符合要求的模型动物为最终入组的实验动物，从而复制卒中后PTSD模型。

藏药中“二十味沉香丸”是由阿旺白桑［5］在“八味沉香丸”的基础上，添加红花、珍珠母、牛黄、降香等二十味药而成，收载于其所著的《验方集萃》中。该方具有调和气血、安神镇静、化瘀止痛的功效。研究表明，其对卒中后肢体运动及精神障碍有良好的治疗效果，可调理精神、意识、思维等。二十味沉香丸以治疗卒中为本，“调隆”以调情志，其特殊的炮炙方法还可降低毒性，提高药效。张涛等［6］研究发现帕罗西汀联合二十味沉香丸可快速改焦虑症患者症状，提高治愈率。由此可见，二十味沉香丸治疗卒中后PTSD具有一定优势。近年来，笔者就二十味沉香丸对卒中后PTSD的作用效果进行了研究，将从新的领域和途径，为卒中患者常见的精神共病提供治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择雄性Wistar大鼠42只，体质量（200±20）g，购自斯贝福实验动物科技有限公司（北京），实验动物许可证号：SYXK（京）2019-0030，并适应性饲养1周。

1.2 实验药品二十味沉香丸（西藏甘露藏药股份有限公司，批号：17063A，规格：56 mg/丸）。组成及比例依据藏医学家阿旺白桑所著的《验方集萃》［5］，药物组成：沉香、广枣、天竺黄、牛黄、兔心红花、马钱子、乳香、石决明、紫檀香、肉豆蔻、鹿茸、木香、丁香、诃子、余甘子等20味药。用生理盐水配成0.072 g/mL的悬浊液。灌胃按照按照每1 mL/100 g体质量给药。帕罗西汀（浙江华海药业股份有限公司，批号：1354E18031，规格：20 mg/片），使用生理水配置成0.045 g/mL的悬浊液。药物配成后分装并密封，置于4℃冰箱中备用。灌胃按照每1 mL/100 g给药。

1.3 仪器设备木质旷场箱由北京中医药大学行为学实验室提供。行为学分析系统（Nodule公司）包括计算机、摄像头以及行为学分析软件。

1.4 模型制备采用MCAO［4］建立局灶性脑缺血模型大鼠模型。1）栓线制备：用长约40 mm，直径为0.23 mm的鱼线，砂纸细磨头端使之变钝，头端涂清漆，处理后头端变圆钝，直径约0.26～0.28 mm，在距此头端10、18、20 mm处分别作标记。酒精擦洗后37℃烤箱烤干，无菌保存备用。2）模型制备：Wistar大鼠禁食12 h后，天秤称取动物体质量，稀释为10%的水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉动物。麻醉后仰卧位固定于手术台上，消毒备皮。经颈部正中切开皮肤，切口约2.5 cm，钝性分离肌肉及皮下组织，暴露颈总动脉（common carotid artery，CCA），注意不要损伤迷走神经，切忌钳夹。然后沿CCA向上分离颈外动脉（external carotid artery，ECA）和 颈 内 动 脉（internal carotid artery，ICA），结扎CCA、ECA，于CCA近分叉处剪一小口，经切口插入制备好的栓线（预先蘸少许肝素钠溶液抗凝），微遇阻力时停止，进线深度约为18～20 mm。如栓线进入血管约10 mm后再进困难，调整栓线角度后仍不能进入，则游离出ICA颅外唯一分支大脑脚穿动脉（perforator artery of cerebral peduncle，PPA），并在PPA的起始部置一血管夹，以防止栓线进入PPA。栓线经过CCA分叉处、ICA进入颅底至较细的大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA），以阻断来源于同侧颈内动脉、大脑前动脉及大脑后动脉的血流供应，即完成对右侧大脑中动脉（middle cerebral arteries，MCA）的阻塞［6］。撤掉PPA处的血管夹，固定栓子后逐层缝合皮肤。清除术野，关闭切口。术后动物分组分笼饲养，不禁食水，室温控制在25℃左右。假手术组只分离血管，不阻断血流。脑中动脉线栓法造模后参照LONGA等［7］的大鼠神经行为学评分法，筛选符合要求的模型动物。

1.5 分组及给药1）将大鼠进行卒中后PTSD造模，随机分为5组，正常组、假手术组每组各6只，模型组、二十味沉香丸组、帕罗西汀组每组各10只。造模后筛选符合要求的模型动物为最终入组的实验动物，重新进行随机分组，最终正常组、假手术组、模型组、二十味沉香丸组及帕罗西汀组每组各6只。2）经过适应性饲养后，将各组动物每晚19∶00进行灌胃，灌胃前将二十味沉香丸悬浊液及帕罗西汀悬浊液摇匀。正常组、假手术组、模型组给予1 mL/100 g生理盐水灌胃，二十味沉香丸组给予1 mL/100 g二十味沉香丸悬浊液灌胃，帕罗西汀组给予1 mL/100 g帕罗西汀悬浊液灌胃，连续灌胃2周。

1.6 观察指标旷场实验采用立方形灰色木质旷场箱，长100 cm，高100 cm，高45 cm，旷场箱底部用黑线划分出25个正方形格（20 cm×20 cm），摄像头置于旷场箱正上方。实验时将动物放入箱内底面中央格，开始进行5 min录像，录像过程中实验人员着黑衣，且避免来回走动。观察记录大鼠直立次数、直立时间、修饰次数及修饰时间。每次实验结束后用酒精清洗方箱内部，以免上一只大鼠留下的气味影响下次测试。录像结束后采用计算机软件对录像进行分析，测得每组大鼠5 min内运动总距离、穿格次数、单次最大运动距离、中央区停留时间等指标。

1.7 统计学方法使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以±s描述，若资料类型为正态分布时，采用单因素方差分析进行组间比较；若为偏态分布的资料，采用秩和检验进行组间比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验测试运动总距离、穿格次数，模型组与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；运动总距离、穿格次数、直立次数、直立时间、修饰次数及修饰时间，模型组与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；运动总距离、穿格次数、直立次数及直立时间，二十味沉香丸组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；运动总距离、穿格次数及直立次数，帕罗西汀组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1—2。

表1 各组大鼠旷场实验水平指标比较（±s）

表1 各组大鼠旷场实验水平指标比较（±s）

注：与正常组比较，b表示P＜0.01；与假手术组比较，d表示P＜0.01；与模型组比较，e表示P＜0.05

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2.2 旷场实验运动轨迹相较于正常组及假手术组，模型组自主运动活性显著降低，活动仅局限在箱内底面中央格到角落；相较于模型组，二十味沉香丸组自主运动显著增加，活动集中在边角部位且与帕罗西汀组无明显差异。见图1。

表2 各组大鼠旷场实验垂直指标比较（±s）

表2 各组大鼠旷场实验垂直指标比较（±s）

注：与正常组比较，a表示P＜0.05；与假手术组比较，c表示P＜0.05；与模型组比较，e表示P＜0.05，f表示P＜0.01

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图1 各组大鼠旷场实验运动轨迹

3 讨论

脑卒中作为全球第二大、中国第一大致死性疾病，严重影响患者的身体健康和生活质量。临床中，脑卒中患者大多伴有不同程度的精神障碍［8-9］，而卒中后PTSD并未受到足够的重视。有数据显示［10］，在无明显意识状态下的脑卒中患者脑卒中3～4周内PTSD的发生率为80.9%。有文献显示［11］，女性患者的发病率更高。相较其他卒中后的精神障碍，PTSD与卒中发生的次数、消极事件等关系更为密切，且有不易随时间而减轻的特点［12-13］。卒中后PTSD发病后迁延难愈，对患者及家属造成严重损伤，然而国内对卒中后PTSD的治疗研究较少，其病机与治疗仍在进一步的探索中。

目前，MCAO是公认的较为理想的制备大脑中动脉缺血的方法，能有效模拟缺血性脑卒中症状。且本团队前期研究［5］显示，MCAO造模后造成了一定的PTSD状态。所以项目组MCAO造模后筛选符合要求的模型动物为最终入组的实验动物，从而复制卒中后PTSD模型。

旷场实验通过检测大鼠在自然状态下的运动情况，能较好地反映出动物的焦虑水平。故本研究采用旷场实验作为评价造模成功与否及药物作用效果的指标。既往研究表明，五羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再摄取抑制剂帕罗西汀对PTSD有较好的治疗效果，且对卒中后精神障碍类疾病也具有一定的治疗作用，因而本研究采用帕罗西汀作为阳性对照药物。

本研究结果表明，模型组大鼠运动总距离、穿格次数较正常组减少；模型组大鼠穿格次数、运动总距离、直立次数、直立时间、修饰次数及修饰时间较假手术组减少，提示模型组大鼠焦虑样行为增加，提示模型成功复制。二十味沉香丸组运动总距离、穿格次数、直立时间及直立次数较模型组增加，提示使用二十味沉香丸在一定程度上能有效改善卒中后PTSD模型大鼠的焦虑样行为；帕罗西汀组大鼠穿格次数、运动总距离、直立次数较模型组增加，提示帕罗西汀对卒中后PTSD有一定的治疗作用。

本研究通过实验表明，二十味沉香丸对卒中后PTSD大鼠的行为学异常具有一定的改善作用，将二十味沉香丸运用于卒中后PTSD的动物实验以进一步研究其治疗机制，将从新的领域和途径，为卒中患者常见的精神共病提供治疗思路，也将为卒中后PTSD的临床治疗提供更多的实验基础。