KY颗粒的HPLC指纹图谱研究

吴 云 高晓艳 陈美玲 吴 翠

江苏康缘药业股份有限公司 江苏 连云港 222047

KY颗粒为中药制剂,处方由黄芪、丹参、赤芍等六味中药材所组成,方中黄芪为君药,发挥补气升阳,固表止汗的作用,由于该制剂的质量标准仅有黄芪甲苷的含量测定项和赤芍、丹参两个药味的TLC鉴别项,质控指标不能全面反映制剂质量变化,其他药味缺少质控指标。

随着高效液相色谱技术（HPLC）和指纹图谱技术在中药研究领域的应用越来越广泛,为了更全面的控制产品质量一致性,通过分析中药制剂的指标性成分,研究并建立指纹图谱或特征图谱的方法,以达到控制中药质量的目的。本文拟建立KY颗粒的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱,更好的控制产品质量稳定性和一致性。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司,配有四元泵、紫外检测器、柱温箱、自动进样器等）;METTLER XSR304电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司,万分之一电子天平）;KQ-250DV超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）。

1.2 试药 丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院,批号:111562-201917）;KY颗粒（江苏康缘药业股份有限公司生产,批号191001）;乙腈为色谱纯;水为自制超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Welch Ultimate XB C18,250mm×4.6mm,5μm）;以乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱;流速为1.0ml/min;检测波长为220nm;柱温为30℃。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于6000。

表1 流动相洗脱比例

2.2 参照物溶液的制备 取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成每1ml含丹酚酸B 60.25μg的对照品溶液,作为参照物溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取KY颗粒约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25ml,密塞,超声提取（功率250W,频率40KHz）30min,滤过,取续滤液,用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。

2.4 对照指纹图谱的建立及共有峰的确定

取KY颗粒10批供试品,照2.3项的供试品溶液的制备方法,分别制备成供试品溶液,按2.1项的色谱条件,精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定。

从色谱软件系统中导出图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）软件,设置时间窗宽度0.1,多点校正后自动匹配,生成对照指纹图谱,见图1。

图1 KY颗粒对照指纹图谱

根据色谱峰峰面积的大小,共确定12个指纹共有峰,不同批次间相同共有峰的紫外光谱基本一致,其中12号峰为丹酚酸B峰,设定为供试品指纹图谱的参照峰（S峰）。10批供试品溶液的色谱图具有对照指纹图谱中的全部12个共有峰,且顺序一致,相似度均大于0.90。

2.5 分析方法验证

2.5.1 精密度试验 取KY颗粒191001供试品,照2.3项制备供试品溶液,连续进样6次,以丹酚酸B峰（12号峰）作为参照峰,计算指纹图谱中其他11个特征峰的相对保留时间的RSD和相对峰面积的RSD,结果相对保留时间的RSD在0.1%～1.0%范围内,相对峰面积的RSD均在0.5%～1.6%范围内,均小于2.0%,表明该方法的精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取KY颗粒191001供试品6份,分别照2.3项制备6份供试品溶液,进样测定并记录色谱图,计算各特征峰相对于丹酚酸B峰（12号峰）的相对保留时间的RSD和相对峰面积的RSD,相对保留时间的RSD在0.4%～1.2%范围内,相对峰面积的RSD在0.9%～1.8%范围内,均小于2.0%,表明该方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取KY颗粒191001供试品,照2.3项制备供试品溶液,分别在0、4、8、12、24小时进样,记录色谱图,以丹酚酸B峰（12号峰）作为参照物,计算指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD,相对保留时间的RSD在0.1%～0.7%范围内,相对峰面积的RSD在0.8%～1.8%范围内,说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.6 供试品的相似度分析

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）软件,以建立的对照指纹图谱为参照图谱,导入10批KY颗粒的图谱,时间窗宽度为0.1,多点校正后自动匹配,计算10批供试品的相似度,结果10批KY颗粒的相似度均大于0.9,表明批间差异较小。

表2 KY颗粒10批供试品的相似度

3 讨论

实验过程中曾考察了三根不同品牌的色谱柱,分别为Welch Ultimate XB C18、Kromasil 100-5 C18和 Agilent Eclipse plus C18,以分离度为考察标准,在本文确定的流动相比例下,使用Welch Ultimate XB C18色谱柱,各色谱峰分离度更优;在实验中选择检测波长时,同时考察了220nm、270nm和321nm等多个波长,从整体性考虑,最终确定在220nm波长下,色谱峰数量、大小均为最佳。