原发性肝癌组织中PKM2、COX2及IAPs的表达及其与放疗敏感性的关系分析

徐明静，芦东徽，高世乐，马 欢，方 向，钱立庭

肝癌是最为常见的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两类，其中原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织。我国是原发性肝癌的高发地区，其死亡率仅次于胃癌、肺癌，是危害性强的恶性肿瘤。目前，原发性肝癌的具体发病机制尚不完全明了，可能与慢性肝炎感染、肝硬化、酒精、黄曲霉素、遗传等因素有关。三维适形放疗是临床原发性肝癌常用的治疗手段之一，但并不是所有患者都对其敏感。因此，探索相关生物学标志物监测放疗敏感度，将有助于患者放疗方案的制定与疗效的预测。肿瘤细胞凋亡受多种基因、信使调控，多项研究表明，M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase，PKM2)、环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)及凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)可能参与抑制肿瘤细胞凋亡，产生放疗抵抗，最终导致放疗失败。但上述蛋白表达与原发性肝癌的患者放疗敏感性关系的报道较少，故本研究将检测原发性肝癌患者肝癌组织中PKM2、COX2、X关联凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)及细胞内凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP-1)蛋白的表达，具体分析其与放疗敏感性的关系，以探讨监测放疗敏感度的潜在标志物。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2018年6月确诊为原发性肝癌患者105例，其中男62例，女43例，年龄45～73(57.23±9.52)岁；病理学类型：肝细胞癌90例，胆管细胞癌4例，混合型肝细胞-胆管细胞癌11例；临床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期19例；分化程度：低分化28例，中分化40例，高分化37例；肿瘤直径≥5 cm者91例，<5 cm者14例；合并乙型病毒性肝炎85例。本次研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准与排除标准

纳入标准：患者经肝脏穿刺活检病理检查确诊为原发性肝癌；具有三维适形放疗指征；初治病例；临床资料完整。

排除标准：复发性或转移性肝癌；合并有其他恶性肿瘤；伴有心、肝、肾等重要脏器功能障碍；合并全身免疫性疾病；精神异常、神志不清者；存在认知障碍者；治疗依从性差。

1.3 方法

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免疫组化法检测肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达 取活检组织样本，行常规石蜡包埋制片，脱蜡水化后滴加双氧水，封闭内源性过氧化物酶，水洗后滴加山羊血清室温下封闭10 min，分别加入PKM2(1 ∶500)、COX2(1 ∶1 000)、XIAP(1 ∶1 000)及cIAP-1(1 ∶500)蛋白一抗工作液，4 ℃下孵育过夜；次日经磷酸盐缓冲液冲洗，在加入适量生物素标记的蛋白二抗工作液(1 ∶4 000),37 ℃下孵育30 min；经磷酸盐缓冲液冲洗，加入二氨基联苯胺(DAB)显色3～15 min，充分冲洗后加入苏木精复染，最后脱水、透明、封片。

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放疗方案 行CT扫描定位，采用三维适形放疗技术，应用瓦里安加速器6MV-X射线照射，总照射剂量为60 Gy，2 Gy/次，1次/d，每周照射5次。

1.4 疗效评估

参照实体瘤疗效判定标准，将患者划分为完全缓解、部分缓解、稳定及进展，其中治疗有效率=(完全缓解+部分缓解+稳定)/总例数×100%，完全缓解和部分缓解为放疗敏感组，稳定和进展者为放疗不敏感组，比较不同放疗效果和敏感性患者癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达的差异。

1.5 随访

随访至2020年6月30日，通过门诊复查形式，随访频率为3个月/次，记录患者复发率、转移率和生存率。

2 结果

2.1 肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表达

本组105例患者肝癌组织中PKM2蛋白阳性86例，阴性19例，阳性率为81.90%；COX2蛋白阳性78例，阴性27例，阳性率为74.28%；XIAP蛋白阳性90例，阴性15例，阳性率为85.71%；cIAP-1阳性表达87例，阴性18例，阳性率为82.86%。免疫组化检测结果见图1。

图1 肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白的表达 ×400A：女性，60岁，PKM2阴性表达(-)；B：男性，76岁，PKM2阳性表达(3+)；C：男性，59岁，Ⅲ期，COX-2蛋白阴性(-)；D：男性，70岁，IV期，COX-2蛋白阳(3+)；E：男性，71岁，Ⅱ期，XIAP蛋白阳性(1+)；F：女性，55岁，Ⅲ期，XIAP蛋白阳性(3+)；G：女性，46岁，Ⅳ期，cIAP蛋白阳性(1+)；H：男性，66岁，Ⅳ期，cIAP蛋白阳性(3+)

2.2 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达与放疗治疗效果的关系

COX2、XIAP蛋白阳性表达者治疗有效率与阴性者比较，差异有统计学意义(

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<0.05)，但不同PKM2、cIAP-1蛋白表达者治疗有效率的比较差异无统计学意义(

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>0.05)，见表1。

表1 不同放疗效果患者PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达的比较

2.3 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达与放疗敏感性的关系

放疗敏感患者临床分期、分化程度、肿瘤直径、肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达情况与放疗不敏感者比较，差异有统计学意义(

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<0.05)；但两组患者年龄、性别、病理学类型及是否合并乙型病毒性肝炎情况的比较，差异无统计学意义(

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>0.05)，见表2。

表2 患者放疗不敏感的单因素分析(n)

2.4 患者放疗不敏感的多因素分析

以患者是否放疗敏感(敏感=0，不敏感=1)为因变量，上述有统计学意义的因素作为自变量，临床分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、分化程度(高分化=1，中分化=2，低分化=3)、肿瘤直径(<5 cm=1，≥5 cm=2)、肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达(阴性表达=1，阳性表达=2)分别赋分后纳入Logistic回归模型，结果显示高临床分期、低分化程度、COX2、XIAP阳性表达是患者放疗不敏感的独立危险因素(

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<0.05)，见表3。

表3 患者放疗不敏感的多因素分析

2.5 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达与患者预后的关系

截止至随访日期，105例患者中22例复发，27例转移，88例存活；XIAP阳性表达者复发率和转移率与阴性表达者比较，差异有统计学意义(

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<0.05)；但不同PKM2、COX2、cIAP-1蛋白表达者复发率、转移率、死亡率及不同XIAP表达患者的死亡率比较，差异无统计学意义(

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>0.05)，见表4。

表4 PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达与患者预后的关系

3 讨论

原发性肝癌的临床治疗中，常对病灶处使用局部放射疗法，以快速杀灭局部癌细胞及邻近侵染细胞，但是实际治疗过程中，不同的患者对放射治疗表现出不同的敏感性，除了病理特征的影响外，还与患者自身个体化差异有关。因此，在原发性肝癌的治疗中，有效监测患者的放疗敏感性对于患者的个性化治疗尤为重要。

PKM2是人体有氧糖酵解中的关键限速酶，其高水平代表糖酵解途径可为肿瘤细胞生长和增殖提供更多的能量和物质，这为肿瘤细胞的恶性增殖创造了有利条件。Liu et al研究显示，PKM2甲基化激活有氧糖酵解后，将促进肿瘤的发生。Long et al研究发现，PKM2在肺癌组织中高表达，并对患者预后有一定的预测能力。COX2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的重要限速酶，正常生理状态下，COX2处于较低水平，当细胞接受某些细胞因子、内毒素、癌基因等刺激时，会大量产生COX2，介导多种蛋白酶、炎性介质等引起炎症反应，参与多种疾病的发生。另外，COX2还可通过前列腺素途径促进肿瘤的增殖，并抑制其凋亡。近年来研究证实，COX2在多种肿瘤组织中呈高表达，如肺癌、胃癌等，并与患者病理特征、预后有关。IAPs可抑制多种刺激触发的凋亡，包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2等8个成员，其特殊的杆状病毒IAP重复区序列，可有效抑制细胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶(caspase)。汪灵 等研究指出，XIAP、cIAP-1和caspase-3在乳腺癌组织中高表达，XIAP和caspase-3可作为潜在的预后评估指标。本研究结果显示，肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白表达阳性率分别为81.90%、74.28%、85.71%及82.86%，与既往研究结果基本相符。

细胞凋亡不仅与肿瘤的发生发展有关，还与治疗敏感性密切相关。马欢 等回顾性分析80例肝癌患者临床资料，发现PKM2在肝癌组织中阳性率高，且与放疗敏感性密切相关。Cheki et al研究显示，COX2在诱导肿瘤细胞对放疗抵抗中有重要作用，可能是放疗防护和放疗增敏的潜在靶点。细胞实验也表明，XIAP、cIAP-1表达与肿瘤细胞放疗敏感性有关。本研究中，COX2、XIAP蛋白阳性表达者治疗有效率明显低于阴性者，PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1蛋白阳性表达者放疗敏感率也低于阴性者，表明肝癌组织中PKM2、COX2、XIAP及cIAP-1阳性表达可能放疗效果不佳。探究原发性肝癌患者放疗不敏感的影响因素发现，高临床分期、低分化程度、COX2、XIAP阳性表达均是患者放疗不敏感的独立危险因素，可能是COX2高表达影响前列腺素代谢，加快细胞分裂，促进新生血管的形成，有利于肿瘤细胞的生长；而XIAP是最具有潜在抑制活性的IAPs成员，可直接抑制凋亡蛋白酶活性，抑制肿瘤细胞的凋亡，因此，COX2、XIAP阳性表达患者放疗不敏感的风险也越高。另外，随访结果显示，肝癌组织中XIAP表达还与患者复发、转移有关。故放疗前COX2、XIAP表达的评估对于原发性肝癌患者有重要的临床意义。同时，对于COX2、XIAP阳性表达者，可在放疗前应用COX2、XIAP抑制剂，这可能是增加放疗敏感性和改善患者预后的新思路。