氯氮平对雄性C57BL/6小鼠淀粉酶和促炎性细胞因子表达的影响

赵彤彤 ，宁晓帅，杨亚婷，张雨龙，任振华，刘寰忠

精神分裂症是一种常见的、严重危害人类健康的精神疾病，其中难治性精神分裂症至少占到20%，氯氮平是治疗难治性精神分裂症的首选药物。但其临床应用受到严重不良反应的限制，其中就包括胰腺炎。关于氯氮平导致胰腺损伤的发病机制尚不清楚，有研究显示促炎性细胞因子在胰腺炎的病程进展中起到重要作用，而血淀粉酶是临床胰腺炎诊断的首选实验室检查项目。该研究旨在探讨氯氮平对小鼠血液以及胰腺组织中淀粉酶和促炎性细胞因子表达的影响，以期有助于初步探索氯氮平导致胰腺损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料

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实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠，购于安徽医科大学实验动物中心[许可证号SCXK(皖)2017-001]，体质量(20±2)g。分笼饲养于明暗周期为12 h昼夜节律，相对湿度45%左右，室温(22±2)℃的普通设施中，普通全价鼠饲料喂养，自由进食及饮水，适应性喂养1周后进行实验。本实验已获得安徽医科大学伦理委员会批准(编号：LLSC20190743)。

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药品与试剂 氯氮平(上海上药信谊药厂有限公司, 批号: H31021152)；水合氯醛(上海生工生物工程有限公司)。RIPA裂解液和BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL超敏发光试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；鼠一抗α-tubulin抗体(T6199)购自美国Sigma-Aldrich公司；兔一抗淀粉酶(amylase)(货号：ab21156)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β(货号：ab9722)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)(货号：ab6671)抗体购自英国Abcam公司；兔一抗IL-6抗体(12912S)购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。TRIzol试剂盒(美国Life Technogies公司)；DEPC-HO(上海捷瑞生物工程有限公司)；RevertAid第一链 cDNA Synthesis试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(上海近岸蛋白科技有限公司)；其他试剂为分析纯。

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主要仪器 电子天平(上海菁海仪器有限公司)；pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；多功能酶标仪、高速低温离心机、荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；电泳仪、电泳槽和转膜仪、化学发光成像仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 实验方法

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模型的制作和标本的处理 48只雄性C57BL/6小鼠按照随机化原则分为四组，分别为对照组、氯氮平(5、10、20 mg/kg)组。氯氮平充分研磨后加入0.9%氯化钠溶液，分别配成浓度为0.5、1、2 mg/ml的悬浊液，每次灌胃前充分摇匀。每日在给药前先称重每只小鼠的体质量，氯氮平5 mg/kg组的小鼠根据体质量灌胃0.5 mg/ml的悬浊液，氯氮平10 mg/kg组的小鼠根据体质量灌胃1 mg/ml的悬浊液，氯氮平20 mg/kg组的小鼠根据体质量灌胃2 mg/ml的悬浊液，对照组小鼠根据体质量灌胃相应体积0.9%氯化钠溶液。上述各组小鼠每日上午9:00灌胃1次，连续14 d给予相应剂量药物。期间各组小鼠饮食自由。末次给药前禁食不禁水12 h，给药后再禁食3 h，随后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠的麻醉状态达到最佳时，剖腹打开小鼠胸腔后完全暴露心脏，然后经心脏穿刺采血置于惰性分离胶促凝管内，低温离心后分离血清置-80 ℃ 冰箱中待测；采血后立即取出小鼠胰腺组织液氮骤冷，置于-80 ℃冰箱保存待用。每组小鼠中的6个胰腺组织用于Western blot实验，另外6个胰腺组织用于荧光定量PCR实验。

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小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的测定 血清amylase采用比色分析试剂盒(ab102523)测定，血清IL-1β、IL-6、TNF-α采用ELISA试剂盒(ab197742、ab222503、ab46105)测定。上述试剂盒均购自英国Abcam公司，严格按照制造商的说明书操作。

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Western blot测定小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达 从每组小鼠各取6个胰腺组织，每个胰腺组织加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液后冰上匀浆提取蛋白，在冷冻离心机中以12 000 r /min离心15 min，使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。根据蛋白浓度计算每个样本的上样量，蛋白样品与上样缓冲液体积比4 ∶1混合, 总体积不超过20 μl，用10%SDS-PAGE分离蛋白, 电泳转移到PVDF膜上，转膜后用4%BSA室温封闭2 h。再将膜溶于含4%BSA中的一抗4 ℃缓慢摇动孵育过夜。洗膜后将膜浸入用二抗稀释液稀释的二抗中, 室温下孵育2 h。参考ECL发光试剂盒说明书，使用化学发光仪进行底物显影曝光拍照，采用ImageJ图像分析软件分析灰度值，所有蛋白条带灰度值均以对应的a-tubulin为基准进行校正, 计算相对灰度值。

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荧光定量PCR测定小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达 从每组小鼠各取6个胰腺组织，剪碎，液氮研磨后，加入TRIzol核酸提取液裂解，冰上匀浆, 按操作说明提取总RNA。室温干燥RNA沉淀，加入DEPC水, -80 ℃保存备用。按逆转录试剂盒说明书在PCR仪上进行逆转录反应，制成cDNA。RT反应条件为：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。取出所得的cDNA作为荧光定量的模板，构建反应体系，PCR反应条件为：95 ℃变性1 min, 95 ℃变性20 s, 60 ℃退火1 min，40个循环。读取目的基因amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α及对应内参基因β-actin的阈值循环数(Ct值), 再采用比较ΔCt值的相对定量法计算目的基因表达水平。PCR引物序列均由上海生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

2 结果

2.1 氯氮平对小鼠外周血amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表达的影响

如表2所示，氯氮平给药后小鼠血清amylase水平升高(

F

=7.890,

df

=3,

P

<0.001)；与对照组相比，氯氮平10 mg/kg和20 mg/kg 组血清amylase水平明显升高(

P

<0.01,

P

<0.001)。氯氮平给药后小鼠血清IL-1β水平升高(

F

=6.976,

df

=3,

P

<0.01)；与对照组相比，氯氮平5 mg/kg和10 mg/kg组血清IL-1β水平明显升高(

P

<0.01)；氯氮平20 mg/kg组与对照组相比升高更加明显(

P

<0.001)。氯氮平给药后也影响了小鼠血清IL-6的水平(

F

=4.033,

df

=3,

P

<0.05)；与对照组相比，氯氮平5 mg/kg组的IL-6水平有所下降(

P

<0.05)。氯氮平给药后对小鼠血清TNF-α水平无影响，差异无统计学意义(

F

=0.272,

df

=3,

P

>0.05)。

表2 四组小鼠血清amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比较

2.2 氯氮平对小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α表达的影响

如图1、表3所示，氯氮平能上调小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达水平(

F

=95.042,

df

=3,

P

<0.001；

F

=184.349,

df

=3,

P

<0.001；

F

=332.945,

df

=3,

P

<0.001；

F

=219.696,

df

=3,

P

<0.001)。与对照组相比，氯氮平5、10、20 mg/kg组的胰腺组织中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达水平明显升高(

P

<0.01)。氯氮平给药后小鼠胰腺组织中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平与它们各自的蛋白表达水平基本一致(

F

=121.605,

df

=3,

P

<0.001；

F

=125.620,

df

=3,

P

<0.001；

F

=70.350,

df

=3,

P

<0.001；

F

=74.281,

df

=3,

P

<0.001)，与对照组相比，氯氮平5、10和20 mg/kg组的胰腺组织中amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平明显升高(

P

<0.01)。见表4。

图1 四组小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α的相对表达量1:对照组；2:氯氮平5 mg/kg组；3:氯氮平10 mg/kg组；4:氯氮平20 mg/kg组

表3 四组小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达水平的比较

表4 四组小鼠胰腺组织amylase、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平的比较

3 讨论

近年来随着非典型抗精神病药物的广泛使用，由抗精神病药引起的药物性胰腺炎逐渐引起关注，据美国FDA统计数据表明抗精神病药中导致胰腺炎报道最多的药物是氯氮平。氯氮平的用药起始时间与胰腺炎的发病进一步支持了因果关系，所有患者均表现为血清amylase水平的升高。有研究显示患者在氯氮平治疗初期即会引起免疫介导的炎症反应，表现为外周血细胞因子的升高。在这期间内，患者被怀疑具有药物相关副作用的风险达到最高。值得注意的是，对于氯氮平一些其他潜在危及生命的副作用已经提出了免疫介导机制。氯氮平治疗后对细胞因子的调节作用并可能伴随着炎症副作用的发生，提示免疫机制可能参与氯氮平副作用的发生。

血amylase是临床胰腺炎诊断的首选实验室检查，本研究结果显示，氯氮平可导致小鼠血清amylase呈剂量依赖性升高。目前关于非典型抗精神病药对血amylase影响的动物实验较少，国外仅有1项奥氮平口服给药的大鼠实验，研究结果显示奥氮平导致大鼠血清amylase明显升高。奥氮平的化学结构和药理作用与氯氮平类似，是抗精神病药物中报告胰腺炎发生率仅次于氯氮平的药物。国内的一项对氯氮平急性中毒患者的研究显示，一次性大剂量服用氯氮平导致患者的血amylase明显升高乃至出现高淀粉酶血症，这进一步提供了药物本身致病作用的证据并支持了亚临床性胰腺炎的可能。

胰腺炎作为一种炎症性疾病，活化的巨噬细胞先诱导胰腺腺泡细胞发生损伤并产生炎症介质的，其中TNF-α和IL-1β是一阶段促炎性因子，它们通过再激活巨噬细胞并调节其他炎症介质如IL-6的释放来增强炎症反应，因此促炎性细胞因子的检测为评估胰腺损伤的严重程度提供了客观依据。该研究结果显示氯氮平不仅使小鼠胰腺组织中amylase的表达显著升高，而且小鼠胰腺组织中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平也呈剂量依赖性地升高。这些结果与经典酒精性胰腺炎小鼠模型中的结果一致，更加支持了胰腺组织中炎性介质的逐渐积累直至胰腺炎症的发生，从而表现为临床上有症状的急性胰腺炎。

本研究表明氯氮平显著升高了血清IL-1β的水平，这与胰腺组织中IL-1β的表达趋势一致。IL-1β已被证实在胰腺炎病程进展中起到核心作用，有研究表明通过使用IL-1β转化酶抑制剂，可以改善急性重症胰腺炎损伤的严重程度。但氯氮平对小鼠血清IL-6和TNF-α表达的影响却与胰腺组织中的趋势不一致，氯氮平在低剂量组使血清IL-6降低了，而氯氮平三组对血清TNF-α均无明显影响。实际上，一直以来关于氯氮平对外周血细胞因子的调节作用并没有得出一致趋势的结论，这有待进一步的研究。