美洲型与欧洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立

高 雅，武欣欣，蒋小玲，贺晓霜，肖 兴*，周双海*

(1. 北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2. 衡阳市畜牧水产事务中心，湖南 衡阳 421001)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种基因组大小约为15 kb的具有囊膜的RNA病毒，现有两种血清型，即美洲型和欧洲型，两者不仅在形态与理化方面相似，在致病性方面也基本相似，都引起同一种疾病，即猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，这是一种以母猪出现早产、流产、死产、产出木乃伊胎等繁殖障碍、仔猪与育成猪出现呼吸系统症状和较高病死率的危害很大的主要传染病[1, 2]。但是，二者在全基因组核苷酸序列同源性方面仅为80%左右，显示出很大差异[3, 4]。中国于1996年首次分离到PRRSV美洲型毒株[5]，在2010年首次分离鉴定出PRRSV欧洲型毒株[6]。PRRSV流行毒株在临床上的多样性给疫病的诊断和防控带来了很大困难。现阶段，病毒基因分型检测主要使用RT-PCR技术，为了提高检测时效而多采用多重RT-PCR方法。国内已有少量研究者建立了关于PRRSV美洲型与欧洲型毒株多重RT-PCR检测方法，但其最低检测都超过103copies/μL[7, 8]，这些方法的敏感性明显不够高，在应用于临床检测时会导致不少假阴性结果。因此，本研究目的是建立一种具有高敏感性的针对美洲型和欧洲型PRRSV的双重RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸模板

美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒核酸模板由北京农学院动物疫病研究室保存。

1.2 病毒重组质粒模板的构建

比对分析PRRSV美洲型毒株、欧洲型毒株的基因序列，之后用分子生物学软件primer5.0设计出AU与AF、EU与EF等2对特异性引物，序列分别为 AU(5′-GACACCACCACCCCCTCC-3′)与AF(5′-CGATGATGGCTTGAG CTGAGT-3′)、EU(5′-TTGACTCCGCACTCTTGCTTCT-3′)与EF(5′-GCCCGCCAACAAATCCTG-3′)，预期目的片段大小分别为650 bp与289 bp。参考文献[9]中的方法来分别构建美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV基因片段重组质粒。

1.3 单项RT-PCR方法条件筛选

单项PCR反应的基础体系是：10 pmol上游引物、10 pmol下游引物、2 μL浓度为105copies/μL数量级的病毒重组质粒模板、总体积为20 μL。单项PCR反应的基础程序是：95 ℃ 200 s；95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32次循环；72 ℃ 600 s。将PCR扩增产物置于20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测。以此单项PCR反应的基础体系与基础程序为基础，从退火温度与引物浓度两个因素来分别筛选美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的单项PCR反应条件。

1.4 双重RT-PCR方法条件筛选

综合优化后的美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的单项PCR反应条件为基础，从退火温度与引物浓度比例两个因素来筛选美洲型PRRSV和欧洲型PRRSV的双重PCR反应条件。

1.5 双重RT-PCR方法的特异性与敏感性检测

用美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和当前临床比较常见的CSFV、PEDV及TGEV等3种RNA病毒的核酸作为模板，检测此双重RT-PCR方法的特异性。之后进行双重RT-PCR方法的敏感性检测，将PRRSV基因片段重组质粒模板进行10倍梯度稀释，美洲型质粒浓度依次为(6.6×107)～(6.6×100) copies/μL，欧洲型质粒浓度依次为(4.0×107)～(4.0×100)copies/μL，并将循环扩增次数增加至40次。

1.6 临床应用检测与统计分析

采集2020年北京、辽宁、湖南等地区5个猪场的200份仔猪与育成猪的血清，参考文献[7]中的方法来提取病毒RNA与进行反转录合成cDNA，用建立的双重RT-PCR方法来检测美洲型PRRSV与欧洲型PRRSV，并从检测阳性样品中随机选取3个来回收其RT-PCR产物进行克隆与测序鉴定。与此同时，用各自的单项RT-PCR方法对200份临床样品进行平行检测。统计分析用卡方检验。

2 结果与分析

2.1 重组质粒构建

以美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV为模板，RT-PCR扩增出相应预期大小的特异性目的条带(图1)，分别为约650 bp、约289 bp。之后分别构建出美洲型PRRSV与欧洲型PRRSV的基因片段重组质粒，序列测定后的核苷酸序列比对结果显示与各自相应的参考基因片段序列的同源性完全一致，表明两种基因型PRRSV的基因片段重组质粒都构建成功。

2.2 单项RT-PCR方法条件优化

不同退火温度进行的单项PCR扩增结果(图2)显示，美洲型和欧洲型PRRSV的目的条带分别在54～58 ℃、56～58 ℃之间较亮，故将两者的退火温度范围确定为56～58 ℃。

以57 ℃为退火温度，不同引物浓度的单项PCR扩增结果(图3)显示，美洲型与欧洲型PRRSV的目的条带都是在10 pmol,15 pmol,20 pmol时较亮，故将两者引物浓度范围确定为10～20 pmol。

2.3 双重RT-PCR方法的条件优化

以优化后的欧洲型与美洲型PRRSV的单项RT-PCR检测方法条件为基础，在56～58 ℃之间采取3个退火温度来进行RT-PCR扩增，电泳结果(图4)显示在57 ℃时扩增出的两个目的条带相对更亮，故将57 ℃确定为最佳退火温度。

以优化后的欧洲型与美洲型PRRSV的单项RT-PCR检测方法条件为基础，取57 ℃为退火温度来进行RT-PCR扩增，电泳结果(图5)显示，在两者引物浓度比例为15 pmol : 15 pmol时扩增出的两个目的条带相对更亮，故将15 pmol : 15 pmol确定为最佳引物浓度比例。

2.4 特异性与敏感性检测结果

以优化后的欧洲型与美洲型PRRSV的双重RT-PCR检测方法条件来进行特异性检测，从图6可清晰看出，以CSFV,PEDV及TGEV的核酸为模板时均无任何条带，而以欧洲型PRRSV与美洲型PRRSV的核酸为模板时则有且只有1条相符合的特异性目的条带，说明建立的欧洲型与美洲型PRRSV的双重RT-PCR检测方法有良好的特异性。

以优化后的欧洲型与美洲型PRRSV的双重RT-PCR检测方法条件来进行敏感性试验，并将循环扩增次数增加为40次，结果(图7)显示，能够扩增出欧洲型与美洲型PRRSV的特异目的条带的最低浓度分别为6.6×101,4.0×101copies/μL，故确定欧洲型与美洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法的灵敏度分别为66,40copies/μL。

2.5 临床检测结果

初步临床检测结果显示，美洲型和欧洲型PRRSV的双重RT-PCR检出率都与其各自的单项RT-PCR检出率完全一致，符合率都是100%。从检测阳性样品中随机选取3个来回收其RT-PCR产物进行克隆与测序鉴定，结果显示其核苷酸序列与预期目的片段基因的核苷酸序列的同源性都超过99%，表明此方法检出的临床阳性样品是准确可靠的。同时发现，不管是单项RT-PCR检测还是双重RT-PCR检测，美洲型PRRSV检出率都极显著(P<0.01)高于欧洲型PRRSV。美洲型与欧洲型PRRSV的个体阳性率分别为44.0%和0，美洲型PRRSV检出率超过40%，说明在这些临床样品中美洲型PRRSV感染比较普遍。

3 讨 论

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害当前养猪业的一种主要疫病，其病原PRRSV存在美洲型与欧洲型之分，两种基因型PRRSV毒株在中国现阶段都有相关临床报道[10]。因此，一种实用的高敏感性的能够快速鉴别PRRSV的美洲型与欧洲型毒株的多重RT-PCR检测方法具有良好临床价值。

虽然多重RT-PCR方法能够显著提高检测效率，但与单项RT-PCR方法相比，最需要考虑的是如何将其检测灵敏度尽可能提高至与后者接近甚至相同。国内已有少量关于PRRSV美洲型与欧洲型毒株多重RT-PCR检测方法的报道，施开创等[7]建立的多重RT-PCR方法的最低检测浓度1.67×103copies/μL质粒浓度，李冰等[8]建立的多重RT-PCR方法的最低检测浓度1.93×103copies/μL质粒浓度。可以看出，二者的检测灵敏度都不太高、都还有较大提升空间。本研究根据PRRSV基因组序列在ORF5基因变异较大的特点，设计不同特异性引物来区分美洲型和欧洲型毒株，根据实验室多年来的PCR扩增经验，主要从退火温度与引物浓度这两个条件进行筛选与优化，建立了一种PRRSV美洲型与欧洲型毒株双重RT-PCR检测方法。此方法对PRRSV美洲型、欧洲型毒株的检测灵敏度分别是6.6×101、4.0×101copies/μL，达到101数量级copies/μL，不仅较国内已有方法的103数量级copies/μL灵敏度[7, 8]提高了24～47倍，而且与各自的单项RT-PCR检测方法一致，显示出非常高的敏感性；初步临床检测显示，两种基因型PRRSV的双重RT-PCR检测结果与其各自的单项RT-PCR检测结果也完全一致，表明在用于临床检测时会明显减少假阴性结果，显示出很高的敏感性。对当前流行相对较广的猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒等RNA病毒，不管是单项RT-PCR方法，还是双重RT-PCR方法，都不能检出；同时，随机测序鉴定结果也显示临床检测阳性样品都符合此双重RT-PCR方法的检测结果，说明此双重RT-PCR检测方法具有良好特异性、完全可用于临床检测。由此表明，建立了1种高特异性与高敏感性的PRRSV美洲型与欧洲型双重RT-PCR检测方法，能够较国内已有方法大幅度降低检测结果的假阴性率。

PRRSV传入中国已有二十多年，美洲型毒株在临床中经常被检出和分离鉴定，直到2010年后才有欧洲型毒株被检出和分离鉴定的报道，之后关于欧洲型毒株的报道逐渐增多[11-12]。施开创等[7]报道用多重RT-PCR方法从广西地区176份样品中发现美洲型与欧洲型PRRSV的检出率分别为25.57%和0%，李冰等[8]报道用多重RT-PCR方法从辽宁地区183份样品中发现美洲型与欧洲型PRRSV的检出率分别为18.03%和1.64%。本研究用建立的双重RT-PCR方法检测2020年全国部分地区的200份血清样品后发现，美洲型PRRSV的阳性率为44%，欧洲型PRRSV的阳性率为0%。不同研究者报道的欧洲型与美洲型PRRSV的临床检出率不尽一致，这可能与临床样品的采集时间与地区等因素有关。综合已有报道数据来看，美洲型PRRSV的临床感染普遍显著高于欧洲型PRRSV感染，部分地区的欧洲型PRRSV感染率甚至为0，提示当前国内对PRRS的防控重点仍然要着力于美洲型PRRSV。