不同生育期臭氧熏蒸对水稻光合作用及生长的影响差异

付娆，尚博，张国友，冯兆忠

（南京信息工程大学应用气象学院，江苏省农业气象重点实验室，南京 210044）

近地表臭氧（O3）是光化学烟雾的主要组成部分，由氮氧化物与一氧化碳（CO）、甲烷（CH4）和挥发性有机化合物（VOCs）等前体物经过一系列的光化学氧化生成的二次污染物[1−2]。随着工业化和城市化的快速发展及人类活动的加剧，O3前体物排放的增加导致全球地表 O3浓度已经从 19 世纪末的 10 nmol·mol−1上升到超过40 nmol·mol−1[3]，并将持续增加。在夏季，全球近四分之一的国家和地区正面临近地层O3浓度高于60 nmol·mol−1的威胁[4]，超过 O3对植物的危害阈值（40 nmol·mol−1）[5]。O3污染已成为我国严重的生态环境问题[6]，尤其是长三角地区[7−8]。据统计[9]，O3污染导致长江三角洲地区水稻年平均减产量为2.445×109t，占实际产量的9.1%，造成年经济损失为10.27 亿美元。可见，当前O3浓度已对我国水稻产量造成了严重损失。

地表O3是一种动态的、存在时间较短的空气污染物，它直接通过氧化作用破坏细胞[10]，对敏感植物造成诸多不利影响[11]，有害于人类健康和植被生长。叶片是O3直接的危害器官，O3通过气孔扩散进入叶片后会首先进入质外体空间，在质外液中溶解后与质外体的物质反应生成多种活性氧自由基（ROS），存在于质外体中的抗氧化物质作为第一道防线，将部分O3/ROS 解毒，而未与质外体反应的O3/ROS 则进入共质体内，启动次级解毒响应机制[12]。然而，在长时间高浓度的O3熏蒸下，一旦ROS 的累积量超过植物自身的解毒防御阈值，便会引起细胞程序性死亡[13]，从而加速叶片衰老[14]、降低叶绿素含量，导致光合速率下降[15−16]，抗氧化系统被破坏[17−18]，造成叶片可见损伤[11]，最终导致作物产量下降[19−20]，矿质元素含量升高[21]，造成严重的经济损失[22]。可见，研究O3污染对作物的影响对于农业环境保护和经济发展具有重要意义。

目前已开展了大量关于O3对水稻叶片生长[14]、生理生化[15，18]、产量[20]以及营养元素利用[21]影响的研究。AINSWORTH 等[23]通过整合分析发现当O3浓度平均升高到 62 nmol·mol−1时，水稻的光合速率降低 28%，气孔导度（Gs）降低23%，最终导致产量下降14%。然而这些研究都是在水稻的整个生育期进行O3熏蒸，对不同生育期O3熏蒸对水稻生长的影响差异的研究较少。PANG 等[24]利用江都开放式 O3熏蒸（O3−FACE）平台，在整个生育期对两个水稻品种（汕优63和武育粳3号）进行1.5倍大气O3浓度熏蒸试验，结果表明，汕优63 比武育粳3 号光合及产量更敏感，但是两个水稻品种在应对不同生育期O3熏蒸时是否有差别仍然未知。水稻是世界三大主要粮食作物之一，其中90%以上的水稻生长和消费均发生在亚洲[25]。考虑到作物不同生育期对O3的敏感性有所差异，因此探究不同生育期O3熏蒸对水稻的影响可为O3防护时段提供科学依据，从而在水稻生长的特定生育期采取精准的调控措施，最终为有效减缓O3污染对水稻造成的伤害提供理论依据。基于此，本研究利用开顶式气室（OTC）在水稻生长的不同生育期（分蘖拔节期和抽穗灌浆期）进行O3熏蒸试验，探究两个水稻品种（汕优63 和武育粳3 号）在不同生育期暴露于相同的O3剂量下，植株生长及叶片光合特性的响应差异，为有效防治O3污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于江苏省扬州市江都区南京信息工程大学扬州绿色农业研究与示范基地（119°43′E，32°25′N），属亚热带季风气候，该地2009—2018 年平均气温16.2 ℃，年平均降水量1 131.3 mm，年日照时间1 936.1 h，年无霜期>290 d，当地实行长期的稻麦轮作体系，是典型的农田生态系统。

1.2 试验设计

本试验在OTC 中进行，OTC 为高2.3 m、直径4.8 m 的正八面柱体，顶部留有直径约3 m 的开口。以洁净的氧气（O2）作为气源，用O3发生器（HY003，济南创成科技有限公司）产生O3，通过鼓风机（CX−125，上海全风实业有限公司）将混合空气送入每个OTC 内，最终使OTC 内O3均匀分布。使用49i O3分析仪（美国Thermo Scientific 公司）对OTC 内中心位置O3浓度进行实时监测与记录，根据OTC 内O3浓度与设定目标O3浓度的差异，通过质量流量计控制供应的O2流量来控制气室内O3的浓度。使用HOBO 气象站（美国Onset Computers公司）每隔5 min监测OTC内外温度、湿度及光合有效辐射参数，每日熏蒸时间最长为10 h（8：00—18：00），遇到雨天则关闭仪器停止通气。

本试验选用的两种供试水稻品种分别为杂交稻汕优63和粳稻武育粳3号，均是当地普遍种植的水稻品种。2020 年 5 月 20 日进行育苗，7 月 2 日将长势一致的幼苗插秧至底部直径22 cm、高31 cm 的圆形花盆中，花盆中所用土为当地农田土壤。同时将每个品种的各10 盆水稻随机放入气室内，适应气室内的生长环境。

试验设置2 个O3处理：CF（过滤大气，使用活性碳吸附空气中的O3）和NF40（环境大气+40 nmol·mol−1O3），每个 O3处理设置 3 个 OTC 重复（n=3）。本试验共设置3 种处理：CF，即水稻始终位于CF 气室中；O3−1，即水稻在分蘖拔节期位于NF40 气室进行O3熏蒸，其他生育期在CF 气室中（O3熏蒸自7 月25日开始，8 月 25 日结束，共计熏蒸 32 d）；O3−2，即水稻在抽穗灌浆期位于NF40 气室进行O3熏蒸，其他生育期在 CF 气室中（O3熏蒸自 8 月 26 日开始，9 月 18日结束，共计熏蒸 24 d）。其中，O3−1 和 O3−2 处理下的O3累计剂量AOT40 值（试验期间小时O3浓度超过40 nmol·mol−1的累计值）分别为（9.54±0.41）µmol·mol−1·h 和（9.61±0.23）µmol·mol−1·h，两个水稻品种在分蘖拔节期和抽穗灌浆期暴露于近似相等的AOT40 中。此外，CF 处理的 AOT40 值为 0.49 µmol·mol−1·h。所有的试验都在相同的 OTC 内开展，试验期间OTC 内外温度分别为32.8 ℃和30.4 ℃，相对湿度分别为72.4%和74.0%，虽然OTC 内温度比室外温度高约2.4 ℃，但当前研究是比较不同O3处理的影响，不涉及室内外比较。

1.3 指标测定

1.3.1 株高和比叶重指标测定

株高：9 月19 日在每个OTC 内不同处理的水稻中各随机选取2 盆植株，测量植株主茎基部到叶顶的长度。

比叶重（LMA）：9月21日随机取下每个OTC中不同处理的两片水稻旗叶叶片，使用HP LaserJet MFP M227−M231 打印机扫描叶片，利用 Image J 计算叶片表面面积，之后将叶片装入信封中放进80 ℃烤箱烘干至恒质量，用万分之一天平称取其干质量，比叶重（g·m−2）=叶片干质量（g）/叶面积（m2）。

1.3.2 光合特性指标测定

采用 Li−6800 便携式光合测定仪（美国 LI−COR公司）于 9 月19 日和20 日测定光合速率−CO2浓度响应曲线（A−Ci曲线），对不同CO2浓度对应的光合速率进行拟合，具体测定方法：晴天9：00—15：00 在每个OTC内每个品种每种处理随机选取两盆植株，在饱和光下诱导15~30 min 后，选择受光照条件好的旗叶叶片进行测定，共测定36条A−Ci曲线。参数设置如下：每条曲线设置12 个 CO2浓度，分别为400、300、200、100、60、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600µmol·mol−1，光合有效辐射设置为 1 500 µmol·m−2·s−1，叶室温度控制在（32±2）℃，空气相对湿度为50%±5%。随后从每条曲线的数据中挑选出第一个CO2浓度为400 µmol·mol−1时的叶片的气体交换参数和叶绿素a 荧光参数作为光饱和下的光合作用特征数据。其中气体交换参数包括饱和光合速率（Asat）、Gs 和胞间 CO2浓度（Ci），叶绿素 a 荧光参数包括：PSⅡ反应中心激发能捕获效率（F′v/F′m）、光化学淬灭系数（qP）、PSⅡ实际光化学量子效率（PhiPS2）。根据SHARKEY 等[26]的方法拟合确定最大羧化速率（Vcmax）和最大电子传递速率（Jmax），并将Vcmax和Jmax的值校准到25 ℃。气孔限制值（Ls）=1−胞间CO2浓度（µmol·mol−1）/大气 CO2浓度（µmol·mol−1）。

1.3.3 光合色素指标测定

光合色素的测定：9月21日选取完成测定光合速率的叶片，用打孔器取直径为0.7 cm的圆形叶片放入2 mL 95%的乙醇中浸泡，并放入4 ℃冰箱中黑暗保存，直至完全褪色。将提取液分别于664、649 nm 与470 nm 处测定吸光度，根据LICHTENTHALER[27]的方法得到叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、叶绿素总量（Chl a+b）和类胡萝卜素（Car）的含量。

1.3.4 叶片氮含量指标测定

将已烘干至固定质量的叶片放在球磨仪中进行研磨，使用元素分析仪（Flashsmart CN，意大利）测定单位质量的叶片氮含量（Nmass），单位面积的叶片氮含量（Narea，g·m−2）=单位质量叶片氮含量（mg·g−1）×比叶重（g·m−2）×10−3。

1.4 数据处理

试验数据先用Excel 2010进行初步整理，经SPSS 23.0 检验数据的正态性与方差齐性后，运用JMP 10.0进行不同品种和处理间的双因素方差分析，采用Tukey−Kramer HSD进行检验，分析不同处理间的差异显著性。运用Sigmaplot 14.0做图，柱形图中的数据为平均值±标准差（SD），统计结果（P值）附图中。

2 结果与分析

2.1 不同生育期臭氧熏蒸对水稻株高和比叶重的影响

不同时期O3熏蒸导致两种水稻的株高显著降低（P<0.01）。综合所有处理，汕优63 的平均株高比武育粳3 号高36.5%且达到显著性差异（P<0.01）。与CF 相比，O3−1和O3−2处理导致汕优63的株高分别下降7.5%和6.9%，武育粳3 号的株高分别下降4.5%和3.3%，其中汕优63的降幅达到显著水平（图1）。两种供试水稻的LMA值在不同处理间无显著性差异，株高和LMA值均未出现处理和品种间的显著交互作用。

2.2 不同生育期臭氧熏蒸对水稻叶片光合特性参数的影响

不同生育期O3熏蒸导致两种供试水稻的Asat和Gs 变化达到显著水平（P<0.01）。相对于CF 处理，汕优 63 在 O3−2 处理下的Asat和 Gs 分别显著下降 44.3%和 55.2%，两个水稻品种的Asat和 Gs 值均为 O3−1 处理大于O3−2处理。而不同时期O3熏蒸对两种供试水稻的Ci值无显著影响（图2）。

在不同生育期进行O3熏蒸显著降低了两种供试水稻的F′v/F′m 与PhiPS2 值（P<0.01），qP 变化不显著。相对于 CF 处理，汕优 63 和武育粳 3 号在 O3−2 处理下的F′v/F′m 值分别显著下降10.9%和11.0%，武育粳 3 号 O3−2 处理下的 PhiPS2 值比 CF 处理显著低25.8%（图3）。

由图4 可见，不同生育期O3熏蒸处理下，两种供试水稻的Vcmax和Jmax的降幅均达到显著水平（P<0.01和P<0.05）。其中，汕优 63 和武育粳 3 号在 O3−2 处理下的Vcmax值比CF 处理分别低48.2%和38.2%，O3−2处理下的汕优63的Jmax值较CF 处理低51.8%，差异达到显著水平。Ls 与Ci 变化趋势相反。两种水稻的Vcmax/Jmax值均表现为 O3−1>O3−2。不同品种及处理与品种的交互作用对光合特性的影响均未达到统计学显著。

2.3 不同生育期臭氧熏蒸对水稻叶片光合色素含量的影响

不同时期O3熏蒸处理下两种水稻的Chl a、Chl b和Chl a+b 的变化一致，虽未达到显著水平，但O3−2处理降幅大于O3−1 处理，两个水稻品种的Chl b 含量差异达到显著水平（P<0.01）。对于Car，汕优63 表现为 O3−1 处理大于 O3−2 处理，而武育粳 3 号则相反。不同O3处理和处理与品种的交互作用均未达到显著水平（图5）。

2.4 不同生育期臭氧熏蒸对水稻叶片氮含量的影响

不同生育期O3熏蒸处理下水稻的Narea的变化达到显著水平（P<0.05），同时两个水稻品种的Narea差异显著（P<0.05），Nmass变化不显著，两种水稻品种的Nmass和Narea含量均表现为O3−1>CF>O3−2，但未出现显著的O3处理与品种交互作用（图6）。

3 讨论

光合作用是绿色植物积累有机物的最重要方式，并最终决定植物生物量。叶绿素荧光是光合作用光反应的重要指标，也是了解逆境下生长的植物光化学和非光化学现象的重要工具[28]。本研究发现，与CF相比，汕优 63 的Asat值和武育粳 3 号的 PhiPS2 值在O3−2处理下显著降低，同时两个水稻品种的F′v/F′m的平均值也显著降低，这表明O3对两个水稻品种不同生育期光合作用的影响存在差异，在抽穗灌浆期影响更大。已有的研究表明，O3能加剧叶绿体膜系统的膜脂过氧化作用，使水稻的膜系统遭到损害，进一步导致叶绿素降解，叶绿素含量下降，最终使得叶片加速衰老。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，通常被认为是影响光合作用的重要因素之一[29]。与光合参数一致，不同生育期O3熏蒸导致叶绿素含量下降，O3−2处理降幅大于O3−1处理，表明水稻抽穗灌浆期对O3响应更大。这与前人对其他作物的研究结论一致，即O3对作物的灌浆期影响较大[30]。PLEIJEL等[31]在春小麦的不同生育期进行相同剂量的O3熏蒸试验，发现在开花期至成熟期进行O3熏蒸引起的产量损失达到11%，而开花期前熏蒸产量损失仅为2%，证实O3对小麦开花期至成熟期影响更大。此外，在对豆类[32]作物的研究中也有相似结论，开花后O3暴露对豆荚产量的影响比开花前更大。

在田间试验中，Asat往往受到气孔和非气孔两个因素共同限制，有研究表明O3引起的Asat降低主要原因是非气孔因素[33]。叶片内Rubisco 的活性Vcmax以及RuBP 再生的最大速率Jmax都能够反映限制植物光合的非气孔因素[34]。FENG 等[35]和 LI 等[36]对小麦和木本植物进行了整合分析，结果表明，平均O3浓度为73 nmol·mol−1时小麦Vcmax降低 18%，平均 O3浓度为 71 nmol·mol−1时 我国木本植物Vcmax和Jmax分别降低 了19%和20%。FENG 等[17]利用FACE 平台探究O3对5个不同冬小麦品种光合作用影响的差异，结果表明O3对不同小麦品种影响的差异主要归因于非气孔因素（如抗氧化酶）而不是Gs。在本研究中，O3对两个水稻品种的影响也更多是由非气孔因素限制。相对于 CF，O3−2 处理导致汕优 63 的 Gs 和Jmax的降幅均达到显著水平，两种水稻品种在O3−2 处理下的Vcmax平均值较CF 处理显著降低43.2%，Ls 变化不显著。光合、荧光及Vcmax和Jmax参数表明O3对水稻抽穗灌浆期影响更大。

LMA 是衡量植物对O3敏感性的重要指标，已有大量研究表明O3能显著降低木本植物叶片的LMA[37]，LMA 值越大，植物对 O3敏感性越低[38]。在本文研究中，不同时期O3熏蒸导致两个水稻品种的LMA 降低，但降幅未达到显著，这与PENG 等[39]对玉米的研究结果一致，可能与O3熏蒸时间较短或水稻抗性较强有关。两个水稻品种在O3−1处理下的LMA更高，这表明分蘖拔节期处理下的水稻O3敏感性更低，抗性更高。叶片氮主要存在于蛋白质、核酸和叶绿体中，对植物光合作用起关键作用，其浓度与光合速率、电子传递速率、羧化速率及叶片抗氧化能力密切相关。已有的研究表明O3浓度升高不仅增加Nmass、降低Narea，还改变了氮在叶片不同功能上的分配[40]。而在本研究中，O3−1 处理下的Nmass和Narea值相对 CF处理有所增加，而O3−2 处理下则相对减少，这说明在抽穗灌浆期进行O3熏蒸会使叶片的抗氧化能力减弱，抗氧化系统对ROS 的解毒和修复功能减弱，导致ROS累积，使植物的光合作用和生理代谢机能受到限制。LMA 与叶片氮含量的变化证实O3对两个水稻品种生长在抽穗灌浆期影响更大。

已有的研究表明[24]，O3导致汕优 63 比武育粳 3 号的Asat和叶绿素含量下降时间更早、幅度更大，结合产量数据，认为在整个生育期进行O3熏蒸时，汕优63比武育粳3号更敏感。本研究发现，不同生育期O3熏蒸导致两个水稻品种的光合与生长指标降幅接近，表明在不同生育期进行O3熏蒸，两个水稻品种对O3的敏感性是相似的。此外，两个水稻品种仅在株高、Chl b和Narea值方面存在显著差异，而其他光合指标品种间无显著差异，并且水稻的生长及光合参数均未表现出显著的品种与O3处理的交互作用，表明本试验中汕优63 与武育粳3 号在应对不同生育期O3熏蒸时的响应相似。

本试验结果表明不同生育期O3熏蒸对两个水稻品种的光合作用及生长的影响存在显著性差异，水稻抽穗灌浆期对O3响应更强，但两个水稻品种应对不同生育期O3熏蒸时的响应是相似的。本试验在OTC内进行，与外界自然环境存在一定差距，而且盆栽试验易受到在气室中所处位置的影响及根系限制。因此，可进一步在大田试验中利用O3−FACE 平台，在水稻生长的不同生育期开展O3熏蒸试验，验证本试验结论，为水稻生长的不同生育期对O3胁迫敏感度提供可靠依据。本试验结果有利于更加准确且有针对性地采取防治措施，如采取水肥一体化管理措施或外源喷施O3防护剂等，对水稻生长的关键生育期进行精准的防护，从而有效减缓O3造成的水稻减产。

4 结论

（1）O3对两个水稻品种的不同生育期影响不同，对抽穗灌浆期光合作用及生长的影响更大。

（2）杂交稻汕优63 和粳稻武育粳3 号对O3的响应相似。