尿路感染B群链球菌的耐药特征与CAMP试验敏感性分析

时翠销，王 刚，李亚娟，黄 颖，徐元宏

B群链球菌(group B

Streptococcus

，GBS)又名无乳链球菌，常寄居于呼吸道、泌尿生殖道、胃肠道，是一种重要的人类机会致病菌，引起多种侵袭性疾病。 虽然医院感染最常见的致病菌为革兰阴性杆菌，但是GBS在20世纪90年代已成为成人急性泌尿系统感染的重要原因，关于尿路感染的GBS耐药特征及耐药基因研究较少。CAMP反应基于

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基因编码的CAMP因子的促溶血活性，CAMP因子在金黄色葡萄球菌分泌的鞘磷脂酶的作用下引起红细胞膜裂解，产生的溶血反应临床上常用于鉴定GBS。最近，也有研究用PCR检测

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基因来鉴定GBS。自21世纪初以来，已有在针对牛乳腺炎的研究中分离出CAMP阴性的GBS。该研究对尿液标本中分离的51株GBS进行药物敏感性试验及耐药基因检测，以了解尿路感染GBS的耐药特征，为临床合理使用抗生素提供参考；探究CAMP试验和

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基因作为临床鉴定GBS指标的敏感性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与鉴定

收集安徽医科大学第一附属医院2019年6月—2020年9月保存的来自尿液标本的GBS共51株，已去除相同患者及因冻存不当死亡的菌株。菌种接种于羊血平板，长出菌落后，进行触酶试验，经基质辅助激光解吸电离飞行质谱 (MALDI-TOF MS，法国生物梅里埃公司) 重新鉴定，质谱鉴定实验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 8739 。

1.2 CAMP试验

研究使用2个批次哥伦比亚羊血平板(合肥天达诊断试剂有限公司)，无乳链球菌ATCC 13813和化脓链球菌ATCC 19615分别为阳性质控和阴性质控菌株。将产溶血素的金黄色葡萄球菌ATCC 25923在血琼脂平板上划一横线，再取收集的GBS与前一划线作垂直接种，两者相距0.5～1 cm, 接种后，将羊血平板在35～37 ℃需氧培养18～24 h。采用2个批次的血平板做重复实验，垂直线交界处的β-溶血的箭头形区域为阳性CAMP反应，彩虹样细溶血区域为弱阳性CAMP反应，无溶血区域为阴性CAMP反应。

1.3 细菌药物敏感性试验

采用纸片扩散法(英国Oxoid公司)和Vitek 2 Compact 自动化微量肉汤稀释法(法国梅里埃生物公司)进行药物敏感性试验，结果判读及解释参照CLSI和EUCAST文件进行。

1.4 红霉素诱导的克林霉素耐药检测

红霉素耐药、克林霉素敏感或中介的GBS, 红霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)药敏纸片边缘相隔12 mm放置。35 ℃培养18～24 h，靠近红霉素药敏纸片一侧的克林霉素抑菌圈出现“截平”现象，即诱导克林霉素耐药试验阳性，为诱导表型(iMLSB)。

1.5 耐药基因、16S rRNA及

基因检测

参照文献设计红霉素、克林霉素、四环素、喹诺酮类等抗生素耐药基因引物，以及16S rRNA、

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基因引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。煮沸法提取细菌总DNA：将菌种接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35 ℃培养18～24 h，挑取新鲜的单克隆菌落于500 μl TE缓冲液中，振荡器上涡旋混匀后于水浴锅中煮15 min，冰上放置5 min后，12 000 r/min离心10 min，离心后取300 μl上清液为DNA模板。PCR扩增耐药基因条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，42～55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离(1.2%，110 V，40 min)，并由上海生工进行测序，测序结果与GenBank上的核苷酸库进行BLAST比对。

表1 16S rRNA、cfb及耐药基因引物序列

1.6 统计学处理

采用WHONET 5.6软件对细菌药物敏感性结果进行统计分析，计算PCR法检测耐药基因、16S rRNA 和

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基因的检出率。

2 结果

2.1 感染GBS患者的一般临床资料及科室分布

51例感染GBS的患者中，男性23例，女性28例，男女比例为1 ∶1.2。易感人群为中老年群体，年龄≥45岁的有41例(80.4%)，<45岁的仅有10例(19.6%)。患者主要分布在泌尿外科和内分泌科，分别为24例(47.1%)、16例(31.4%)，风湿免疫科、血液内科、皮肤性病科、国际医疗全科医学科各1例(2%)，肾脏内科5例(9.8%)，消化内科2例(3.9%)。

2.2 CAMP试验结果

51株GBS中，CAMP阴性3株，弱阳性9株，阳性39株。见图1。

图1 CAMP试验结果A：1、2、3为CAMP试验阴性；B：4、5、6为CAMP试验弱阳性；C：7、8、9为CAMP试验阳性；P：阳性对照；N：阴性对照

2.3 细菌药物敏感性分析

药物敏感性结果显示，51株GBS对氨苄西林、达托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/达福普汀、替加环素、万古霉素均敏感，对喹诺酮类抗生素左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星及克林霉素比较敏感，耐药率分别为47.1%、49.0%、47.1%、49.0%，对四环素、红霉素耐药性高，耐药率均为66.7%。红霉素、克林霉素均敏感型10株，红霉素耐药的34株GBS中，有22 株 (64.7%)为固有表型(cMLSB)，5株 (14.7%) 为iMLSB型，M型有7株 (20.6%)，克林霉素耐药的25株GBS中L型有3株 (12%)。见表2。

表2 尿液中51株GBS药敏结果[n(%)]

2.4 耐药基因检测结果

通过对尿液中51株GBS的红霉素耐药基因ermA、ermB、mefA/E，克林霉素耐药基因linB，四环素耐药基因tetM、tetO, 喹诺酮耐药基因gyrA、parC进行PCR扩增及测序显示，所有耐药基因均有检出，ermA、ermB、mefA/E检出率分别为43.1%、51.0%、33.3%，linB检出率为11.8%，tetM、tetO检出率分别为43.1%、23.5%，40株GBS同时检出gyrA、parC，检出率为78.4%，无单独检出gyrA或parC的GBS。GBS耐药菌株与其携带相关耐药基因具有一定相关性，34株红霉素耐药的GBS都至少含有一种红霉素耐药基因，34株四环素耐药菌株32株(94.1%)含有四环素耐药基因，喹诺酮耐药的菌株均含gyrA、parC耐药基因，14株喹诺酮抗生素敏感的GBS也含有gyrA、parC耐药基因，25株克林霉素耐药的GBS仅有6株含有linB耐药基因。见表3。

表3 51株GBS耐药基因分布情况

2.5 16S rRNA和

基因检测结果

经PCR检测显示，51株GBS 16S rRNA检出率为100%，

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基因检出47株，检出率92.2% (47/51)，其中CAMP试验阴性株有1株

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基因阳性(1/3)，弱阳性株7株阳性(7/9)，CAMP试验阳性株

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基因全部阳性(39/39)。PCR检测结果见图2、3和表4。

表4 51株GBS基因分布情况[n(%)]

图2 16S rRNA基因片段的PCR扩增M1：marker 2000；1～3：CAMP试验阴性株；4～6：CAMP试验弱阳性株；7～9：CAMP试验阳性株

图3 cfb基因的PCR扩增M2：marker 2000；1～3: CAMP试验阴性株；4～6：CAMP试验弱阳性株；7～9：CAMP试验阳性株

2.6 菌株鉴定结果

经生化试验、16S rRNA、

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基因、MALDI-TOF MS鉴定，

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、16S rRNA测序结果BLAST比对，与GBS (登录号：CP008813.1)同源性约为99%。触酶试验阴性，16S rRNA、MALDI-TOF MS 鉴定结果均为GBS。CAMP试验分别为阴性、弱阳性、阳性的三株菌株鉴定结果见表5。

表5 菌株鉴定结果

3 讨论

GBS可引起严重感染，特别是新生儿和产妇多见，如新生儿败血症、产后败血症、心内膜炎和细菌性关节炎。近年来，GBS成为成人尿路感染的重要病原体。GBS分离株的药物敏感性试验对于合理选择抗生素至关重要，本研究中51株GBS均分离自尿液标本，对氨苄西林、达托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/达福普汀、替加环素、万古霉素敏感性都为100%，对四环素、红霉素、克林霉素、喹诺酮类抗生素耐药率高。药敏结果表明，尿路感染的GBS与其他路径感染的GBS耐药特征总体相仿，但对红霉素及四环素耐药率高(66.7%)，iMLSB型有5株，临床上应报告分离株克林霉素耐药。

青霉素是成人侵袭性GBS疾病的一线治疗药物，目前普遍认为GBS在体外对青霉素敏感，在来自日本的分离株中检测到青霉素敏感性降低，被认为是青霉素结合蛋白(PBP)2X表达降低所致。本研究中，尿路感染的GBS菌株对青霉素敏感性为100%，表明青霉素仍是治疗GBS感染的较佳选择，而对青霉素过敏的患者,可用红霉素和克林霉素替代。研究中观察到54.9%的分离株多重耐药，以红霉素、克林霉素和四环素共耐药(27.5%)为主。

红霉素和四环素的耐药率 (66.7%) 较高，主要耐药基因为ermB和tetM，广东地区红霉素耐药也是主要由ermB介导，25株克林霉素耐药的GBS仅检出6株介导克林霉素耐药的linB基因，这与中国南方地区(24.6%)的检出率一致，低于南非的研究结果，而在韩国的一些调查中没有检测到linB基因，5株含有linB基因的GBS为红霉素和克林霉素同时耐药的cMLSB型，表明linB基因也可能与红霉素耐药有关。有研究指出parC第79位密码子和第83位密码子突变是高水平喹诺酮类耐药的主要决定因素。本研究中，喹诺酮类抗生素耐药的GBS gyrA和parC均有检出，但是也有检出14株喹诺酮敏感的GBS，这可能与gyrA和parC不表达有关，或者存在其他调节喹诺酮抗生素耐药的基因或途径。

GBS表达的CAMP因子是一种成孔蛋白毒素，其在分子水平上的协同溶血作用机制目前尚不清楚。本研究中分离出3株CAMP阴性的GBS, Hassan et al研究认为CAMP阴性株均含有

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基因，与之相反，Abdulmawjood et al分离的4株表型CAMP阴性的GBS,

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基因均为阴性，本研究3株表型CAMP阴性株仅1株

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基因阳性，2株阴性。这表明CAMP因子的表达减少或表达途径上其他地方的基因缺陷及

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基因缺失均可能导致CAMP试验阴性，已有研究指出影响

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基因的染色体缺失会导致CAMP试验阴性。本研究中，CAMP试验弱阳性的菌株中也存在2株

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基因缺失，可能还存在类似于CAMP促溶血活性的其他蛋白调节通路，有待进一步研究。有研究建立了一种新的针对

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基因片段的核酸扩增方法，敏感性为95.5%,与本研究92.2%的检出率较为一致，这与传统认为GBS均含有

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基因的观点不同。因此，对于GBS的检测CAMP试验与

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基因检测均缺乏一定的敏感性，应与细菌培养联合检测，但是对于基层医院，CAMP试验仍是一种简便的检测方法。该研究所收集的标本仅来自安徽的一所三甲医院，后续宜扩大标本量进行更加深入和广泛的研究。总之，药敏试验为临床合理使用抗生素提供参考，该地区尿液中GBS红霉素和四环素耐药严重，耐药基因以ermB和tetM为主，临床上应加强对红霉素介导的克林霉素耐药的检测，CAMP试验及

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基因阴性值得关注，防止临床检测漏检。