奶牛无乳链球菌性乳房炎的传播途径分析

武乃雯，陈 鹏，朱春燕，刘 凯 , 程 佳，周 曼，韩 博，高 健

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.上海市农产品质量安全中心，上海 青浦 201708；3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

奶牛乳房炎与营养代谢病、肢蹄病并称奶牛三大疾病，虽不造成大批畜群死亡，但对奶牛养殖业的影响不可忽视。一方面使用抗生素造成的弃奶、治疗产生的费用和随之而来的淘汰率影响养殖收益，另一方面使奶牛的生产性能降低，原料奶品质受损，甚至危害人类健康。

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，S.agalactiae)属于革兰阳性B群链球菌，是导致奶牛乳房炎的主要病原菌，分离率较高[1]。无乳链球菌引起的乳房炎通常表现为隐性乳房炎或较为温和的临床型乳房炎，通常表现为乳房肿胀，偶有全身发热、泌乳停止等现象，故较难诊断而导致慢性感染，危害极大[2]。无乳链球菌是造成大罐奶体细胞数上升(>20万个/mL)的主要致病菌，甚至在某些奶牛场的大罐奶体细胞数为10万个/mL时也能检测出无乳链球菌[3]。无乳链球菌性乳房炎在经济上的最大损失为奶牛乳产量下降，感染乳区的产奶量通常会下降40%，甚至更多。且随着体细胞数升高，牛奶干物质(如乳糖和酪蛋白等)比例下降，直接导致牛乳品质下降[3-4]。无乳链球菌性乳房炎通常在挤奶厅中传播，挤奶机、挤奶工的手、乳头清洁毛巾或纸巾等均可作为传播媒介[3]。然而，近年来研究显示，无乳链球菌的来源也可能是环境，病原体也可能存在于粪便和垫料中，进入奶牛乳房内引发感染[5-6]。

为了探索北方某奶牛场无乳链球菌的传播途径，本试验对该奶牛场奶样、粪便、垫料、口腔、奶牛乳头末端皮肤、挤奶员手臂等位点采样，共采集625份样品，进行无乳链球菌的分离培养，并对结果进行分析、解读，得出其在奶牛群中的传播特征，并制定相应防控方案。本试验可为国内无乳链球菌性乳房炎的针对性防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品类型 2019年7月于北方地区某大型奶牛场采集乳汁样品240份、粪便样品20份、垫料样品30份、奶牛口腔样品42份、奶牛乳头末端样品156份、奶衬内壁样品104份、挤奶员手臂样品22份、洗手液和泡杯液样品各15份。

乳汁样品具体分为大罐奶样品、泌乳前期(0～30 d，第1阶段)、泌乳中期(60～180 d，第2阶段)、泌乳后期(180 d以上，第3阶段)、奶牛4个乳区混合奶样、干奶前奶牛4个乳区混合奶样、治愈隔离牛4个乳区混合奶样、治疗牛4个乳区混合奶样和临床型乳房炎患病乳区奶样。各阶段又分为前3把奶和奶样。使用一次性采样杯采集，挤奶时直接接取对应样品，左前、右前、左后、右后4个乳区分别接取5 mL左右奶样，每份样品约20 mL，摇匀并做好标记，置于4 ℃冰箱保存。

奶牛口腔样品分为无乳链球菌性乳房炎治愈后隔离牛群(定义为A群)、无乳链球菌性乳房炎治疗牛群(定义为B群)和非无乳链球菌性乳房炎治疗牛群(定义为C群)。奶牛乳头末端样品依采集时间分为奶牛进入挤奶厅后乳头末端样品(定义为a类)、前药浴结束后乳头末端样品(定义为b类)和后药浴开始前乳头末端样品(定义为c类)，依奶牛类型分为无乳链球菌性乳房炎治愈隔离牛样品(即A群)、治疗牛样品(即BC群)、泌乳前期奶牛样品、泌乳中期奶牛样品和泌乳后期奶牛样品。奶衬内壁环境样品依采集时间分为泡杯前样品(定义为d类)和泡杯后样品(定义为e类)，依奶牛类型分为治愈隔离牛样品(即A群)和治疗牛样品(即BC群)。挤奶员手臂样品(定义为f类)、泡杯液样品(定义为g类)和洗手液样品(定义为h类)均分为健康奶牛挤奶厅(即大奶厅)样品和乳房炎治疗牛挤奶厅(即小奶厅)样品。口腔、奶牛乳头末端皮肤、奶衬内壁、挤奶员手臂(洗手后)均使用浸泡于灭菌生理盐水的无菌棉签进行涂抹，在取样部位涂抹3～5次，涂抹后的棉签置于有少量灭菌生理盐水的离心管中，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。洗手液、泡杯液是液态样品，均使用一次性采样杯采集，采集每个挤奶厅使用后的洗手液、泡杯液，每份样品约50 mL，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。

粪便和垫料样品分别来自临床乳房炎治愈后隔离牛群(乳房炎治疗后在隔离牛群中饲养30 d)和临床乳房炎治疗牛群。粪便样品使用一次性自封袋采集，到对应圈舍采集新鲜粪便，同一圈舍通过5点采样法尽量选取不同位置样品，保证样品均匀性。每份样品约20 g，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。垫料使用一次性自封袋采集，到对应圈舍采集垫料，弃去表层较为干燥的垫料，采集深部潮湿垫料，每份样品湿度均匀，同一圈舍选取不同卧床的垫料。每份样品约20 g，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。垫料样品使用前，取适量样品于适量灭菌生理盐水中摇匀，静止30 min后取上层液体作为垫料浸出液(液态样品)加以使用，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂与仪器 脱纤维绵羊血(TX0030-100 mL)，购自北京索莱宝科技有限公司；BETA-SSA琼脂培养基(HB0312)、改良爱德华琼脂培养基(HB8706)，均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，购自天根生化科技(北京)有限公司；无乳链球菌特异性引物、溴化乙锭(A600195-0001)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(AS221-01)，购自北京全式金生物技术有限公司；西班牙琼脂糖Biowest agrose(111760)，购自上海慧颖生物科技有限公司。另有灭菌棉签若干，一次性自封袋若干，一次性采样杯若干，灭菌生理盐水，ddH2O。立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S)，产自上海博讯实业有限公司；旋涡混合器(HQ-60-II)，产自北京北方同正有限公司；电热恒温水槽(HWS12型)，产自上海一恒科技有限公司；梯度基因扩增仪(Vetri 96)，产自美国ABI公司；台式电子天平(BSA1245-CW)，产自德国 Sartorius 公司；电泳仪(DYY-6D型)、凝胶成像系统(WD-9413B)，均产自北京六一仪器公司；生物安全柜(HR40-IIA2)，产自青岛海尔生物医疗股份有限公司。

1.3 无乳链球菌的分离与纯化 初代培养使用5%绵羊血的BETA-SSA琼脂培养基培养。液态样品(奶样、垫料浸出液、泡杯液、洗手液)和粪便样品用无菌棉签划线，各类拭子样品可用采样时的涂抹棉签划线，置于37 ℃温箱中培养24 h。无乳链球菌在5%绵羊血BETA-SSA琼脂培养基上生长为灰白色、不透明、针尖样小菌落，菌落光滑凸起、湿润有光泽，呈α溶血或β溶血[7]。纯化鉴定培养用5%绵羊血改良爱德华琼脂培养基进行，从初代培养皿中用接种环挑取无乳链球菌疑似菌落接种于纯化鉴定培养基中，置于37 ℃温箱中培养24 h。无乳链球菌在本培养基上生长为淡紫(蓝)色、不透明、针尖状小菌落，菌落光滑凸起、湿润有光泽[8]。

1.4 无乳链球菌的PCR鉴定 挑取纯化培养基上的无乳链球菌疑似菌株，接种至装有脑心浸出液肉汤培养基的离心管中，放至37 ℃恒温培养摇床上培养24 h，得到细菌悬液。根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书对无乳链球菌疑似菌株悬浊液进行DNA提取，获取大片段、高纯度、稳定质量的基因组DNA。提取出的无乳链球菌疑似菌株DNA进行PCR扩增。PCR反应选择50 μL体系：提取的DNA 5 μL，2×RapidTaqMasterMix 25 μL，ddH2O 15 μL，上游引物V1(5′-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3′)2.5 μL，下游引物V2(5′-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3′)2.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 为1个循环，共40个循环；以上循环结束后72 ℃ 延伸10 min[9]。扩增好的无乳链球菌疑似菌株DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，相同大小的DNA分子以相同速度向正极方向运动，电泳条带与标准无乳链球菌菌株条带一致的疑似菌可确认为无乳链球菌。

2 结果

2.1 乳汁样品中无乳链球菌检出率 乳汁样品中总检出率为13.1%，检出率最高的是大罐奶，11份样品中7份都检出了无乳链球菌，检出率为63.6%，存在无乳链球菌全群感染。见表1。

表1 乳汁样品中无乳链球菌检出率

2.2 口腔样品中无乳链球菌检出率 口腔拭子整体检出率较高，42份样品中共检出无乳链球菌11株，总检出率为26.2%。见表2。

表2 口腔样品中无乳链球菌检出率

2.3 乳头末端样品中无乳链球菌检出率 奶牛乳头末端只有两类样品检测出无乳链球菌，一是无乳链球菌治疗牛，检出率为40.0%；二是泌乳中期(60～180 d)奶牛，检出率为16.7%。其他各类乳头末端皮肤拭子样品的无乳链球菌检出率均为0。见表3。

表3 奶牛乳头末端样品中无乳链球菌检出率

2.4 奶衬内壁样品中无乳链球菌检出率 奶衬内壁在挤奶前无乳链球菌检出率为0，挤奶后无乳链球菌检出率为20.0%(治疗牛)和2.1%(泌乳牛)，说明无乳链球菌是在挤奶后乳汁挂在奶衬内壁上的，且经过泡杯液消毒后无乳链球菌被杀死。见表4。

2.5 其他样品中无乳链球菌检出率 其他位点样品中，粪便样品总检出率为25.0%，健康牛奶厅挤奶员手臂上检出率为16.7%，沼渣垫料、泡杯液、洗手液等位点没有检出无乳链球菌。见表5。

表5 其他样品中无乳链球菌检出率

3 讨论

本试验中，大罐奶中无乳链球菌检出率为63.6%，隔离牛无乳链球菌检出率为28.0%，表明该奶牛场存在较为严重的全群感染，感染基数较大。从新产牛阶段到干奶前，各阶段无乳链球菌检出率逐渐降低，到进入干奶期之前降低至0，说明在泌乳前期无乳链球菌的感染率高，而泌乳后期的感染率逐渐下降。这可能与乳腺组织内免疫细胞对乳房链球菌的清除能力有关[10]。由于分娩应激及产后营养代谢病等影响，奶牛的乳腺免疫力在泌乳早期通常低于泌乳后期[11]。从另一方面来说，奶牛在泌乳早期发生乳房炎，会带来更大的经济损失，并导致奶牛的乳腺在以后的泌乳阶段更容易被感染[12]。因此，泌乳前期奶牛无乳链球菌较高的感染率提示，本牛场中需要更为重视干奶期和分娩前后奶牛的健康管理。

目前无乳链球菌的主要传播途径是接触性传播，即在奶厅内通过奶衬、挤奶员的手臂或毛巾等，由患病奶牛传染至健康奶牛的乳区[13]。近年来，也有研究证明，无乳链球菌可以通过粪便和垫料等途径侵入乳房[5-6]。在本试验中，粪便和奶牛口腔中可检测出无乳链球菌，推测可能是饲料和饮水中存在无乳链球菌，并经采食和饮水进入口腔并生长繁殖，形成粪—口途径，这与Jorgensen等的研究结论一致[5]。然而，在本试验中，沼渣垫料中没有检测出无乳链球菌，说明沼渣垫料可能不适于无乳链球菌在体外的生长繁殖，但也不排除检测方法存在一定局限性。此外，该奶牛场新产牛垫料成分为沼渣和稻壳粉的混合物，在新产牛阶段较高的检出率可能与稻壳粉的掺入有关。

在本试验中，无乳链球菌在奶牛乳头末端皮肤检出率较低，仅出现在进厅后的乳头皮肤上，说明牛舍环境中存在无乳链球菌，可能与乳头末端受到粪便污染有关。因此我们推测，在该奶牛场中，存在口—粪—乳房的感染途径。消毒后乳头末端检出率为0，表明挤奶前的消毒操作有效且有必要。然而脱杯后药浴前的乳头末端未发现无乳链球菌，可能与检测数量较少有关，也可能由于乳头末端取样量较少导致。此外，泡杯前的奶衬内壁可检出无乳链球菌，可能是乳头末端皮肤表面的细菌沾到内衬上，也有可能是乳腺深部的细菌沾到内衬上。乳房炎奶厅中挤奶机奶衬的无乳链球菌检出率为20.0%，有可能在患病牛奶厅中，奶衬是一条重要的传播途径；健康牛奶厅奶衬无乳链球菌检出率为2.0%，在健康牛奶厅奶衬可能并非重要传播途径。健康牛奶厅挤奶员手臂拭子无乳链球菌检出率为16.7%，这说明消毒洗手液杀菌效力或洗手操作方式可能存在问题。由于挤奶员接触牛只很多，如果不能保证对手臂进行有效消毒，那么挤奶员的手臂很有可能成为无乳链球菌的重要传播途径[14]。

通过以上分析，该奶牛场主要存在的无乳链球菌传播途径有两条：一是挤奶厅内的接触传播。挤奶厅是牛群密度最大、牛只工作强度最大且所有牛只都要接触的场所，也是引起乳房炎发病的高风险场所[15]。该奶牛场挤奶厅无乳链球菌检出率最高的位点是挤奶员手臂，由于挤奶员持续接触牛群，如果没做好洗手消毒很有可能将无乳链球菌从感染牛只携带至健康牛只，造成更大面积的传播。其次，通过检出结果分析可发现，药浴可有效减少乳头末端无乳链球菌检出率、泡杯可有效减少奶衬内壁无乳链球菌检出率，证明药浴和泡杯操作对切断传播途径起着重要作用。二是口—粪—乳房传播。牛只通过采食和饮水将饲料、饮水中积存的无乳链球菌摄入，给无乳链球菌提供口腔这一繁殖环境，并通过排便将无乳链球菌散播到环境中，最终无乳链球菌通过粪便等环境侵入乳房，造成感染[5]。此外，治愈隔离牛群乳房中仍存在无乳链球菌，可能是因为抗生素治疗并未达到细菌学治愈效果，需要进一步评估抗生素治疗方案[16]。

根据本试验结果，奶牛场应制定一种综合性管控方案。首先，对牛群进行隐性乳房炎检测，及时将感染牛只隔离分群，且保证隔离群和非隔离群不共用挤奶厅。其次，鉴于挤奶厅的重要性，提高工作人员的操作意识，如奶杯泡杯操作、乳头末端药浴操作和挤奶员自身手臂清洁操作，切断奶厅中接触性传播途径。最后，加强隔离群奶牛的饲养管理，提高牛舍清洁度，如清粪频率、卧床维护和垫料消毒，切断口—粪—乳房传播途径。