超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中肌苷及其关联物

陈超 王真 任南 刘梦瑶 纪晓萌 李莹莹 郭文萍

摘 要：建立一种利用超高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中5-腺苷酸（5-adenosine monophosphate，AMP）、5-肌苷酸（5-inosine monophosphate，IMP）、肌苷（inosine，I）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）的方法，并进行方法学考察。结果表明：优化后的方法为样品中加入体积分数3%高氯酸-10%甲醇水溶液后添加匀浆均质子涡旋，离心，调节提取液pH值为5.0后用PEIME HLB柱净化，采用SB-Aq色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.8 ?m），流动相为体积分数0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速0.3 mL/min，正离子多反应监测模式测定，外标法定量;经方法学考察，4 种核苷类成分（AMP、IMP、I、Hx）线性关系良好，相关系数均大于0.996，加标回收率为79.63%～91.08%，相对标准偏差为1.0%～4.5%（n=6）。

关键词：超高效液相色谱-质谱联用技术;鸡肉;正离子多反应监测;5-腺苷酸;5-肌苷酸;肌苷;次黄嘌呤

Determination of Inosine and Its Related Compounds in Chicken by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Chao， WANG Zhen， REN Nan， LIU Mengyao， JI Xiaomeng， LI Yingying*， GUO Wenping

（China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： This study aimed to set up an analytical method to detect 5-adenosine monophosphate （AMP）， 5-inosine monophosphate （IMP）， inosine （I）， and hypoxanthine （Hx） in chicken by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） and to assess its figures of merit. The results showed that the experimental conditions of this method were optimized as follows： samples were homogenized using a vortex mixer by addition of 3% perchloric acid-10% methanol in water followed by centrifugation， and the supernatant extract was purified with a PEIME HLB cartridge after being adjusted to pH 5.0. The analytes were separated on an SB-Aq column （3.0 mm × 100 mm， 1.8 ?m） using a mobile phase consisting of 0.1% formic acid in water and acetonitrile by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min， detected in the positive ion multiple reaction monitoring （MRM） mode， and quantified by the external standard method. The calibration curves for the four nucleoside components had good linearity with correlation coefficients of greater than 0.996. The spiked recoveries ranged between 79.63% and 91.08%， with relative standard deviations （RSDs） of 1.0%–4.5% （n = 6）.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; chicken; positive ion multiple reaction monitoring mode; 5-adenosine monophosphate; 5-inosine monophosphate;  inosine; hypoxanthine

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185

中圖分类号：TS201.2                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）10-0041-07

引文格式：

陈超， 王真， 任南， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中肌苷及其关联物[J]. 肉类研究， 2021， 35（10）： 41-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185.    http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Chao， WANG Zhen， REN Nan， et al. Determination of inosine and its related compounds in chicken by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 41-47. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210709-185.    http：//www.rlyj.net.cn

禽肉是我国主要食用肉类之一，广受消费者欢迎[1]。

禽肉营养丰富，味道鲜美，富含蛋白质、脂肪、风味物质等，是人们膳食中不可或缺的重要组成部分[2]。鸡肉在炖煮过程中可释放小肽、游离氨基酸、无机盐、核酸代谢物等物质，赋予鸡汤一定的风味，核酸代谢物是炖肉中与鲜味相关的主要化合物，其中5-肌苷酸（5-inosine monophosphate，IMP）对鲜味贡献大[3-4]。核苷酸属于一类有机化合物，由嘌呤碱基或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸3 种物质组成，五碳糖通过β-糖苷键连接，与有机碱合成核苷，核苷与磷酸合成核苷酸，核苷和核苷酸是胞内化合物，参与各种调节和代谢功能[5]。动物宰后短时间内，组织中ATP含量变化较小，随着磷酸肌酸的耗尽及糖原酵解停止，ATP合成反应停止，开始迅速分解。糖原酵解产生的乳酸及ATP降解产生的磷酸，使肌肉pH值下降，肌肉达到极限pH值时，大部分ATP降解为5-腺苷酸（5-adenosine monophosphate，AMP），进而分解生成IMP、无机磷酸和氨，IMP进一步降解生成肌苷（inosine，I）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）、磷酸和核糖等[6-7]，AMP及其降解产物结构如图1所示。

随着生活质量的提高，人们对食品的风味、新鲜程度等指标开始广泛关注。近年来，学者开始关注IMP的鲜味贡献，随着IMP降解产生Hx，赋予苦味“异味”，Hx的检测被用于评估食品工业中鱼类的新鲜度。因此无论是研究风味还是研究新鲜度，AMP的降解产物及其相互关系均为肉质评定的重要指标[8-9]。目前，核苷酸及其关联物的研究多集中在生物性样品（如血液、尿液）[10-14]、中药[15]、保健品（如人参、鹿茸）[16-17]、食用菌[18-22]、水产品（如中华绒螯蟹[23]、草鱼[24]、对虾[25-26]、梭子蟹[27]）等，也有学者研究不同贮藏条件下鸡肉IMP的变化规律[7]，同时测定AMP及其降解产物的研究还鲜有报道。核苷酸及其关联物的研究方法主要有毛细管电泳法[9，12，28]、生物传感器法[8，13]、高效液相色谱法[12，25，27]、高效液相色谱-飞行时间质谱法[15，28]、高效液相色谱-串联质谱法[10-11，14]等，由于鸡肉基质较为复杂，为了同时满足分离度、灵敏度及定量的需求，本研究利用超高效液相色谱-串联质谱开发出一种鸡肉中AMP、IMP、I、Hx的高效、简易的分析方法，为同时测定动物源性食品中多种核苷酸关联物提供思路，为动物源性食品的风味和新鲜度指标研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

鸡肉购自北京市某连锁超市，鸡胸肉及鸡腿肉各200 g，搅碎处理。

IMP（纯度100.0%）、AMP（纯度100.0%）、Hx（纯度99.4%）、乙腈（色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司;I（纯度98.0%） 上海泰坦科技股份有限公司;甲醇、三氯乙酸、高氯酸（均为优级纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1290超高效液相色谱-6470串联四极杆质谱仪

美国Agilent公司;S-100涡旋仪、SR-Ⅱw振荡器 日本Taiyo公司;DT1028H超声波提取仪 德国Bandelin公司;CR21N离心机   日本Hitachi公司;Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司;ABM-2均质机 株式会社日本精机制作所。

1.3 方法

1.3.1 提取

鸡肉经组织研磨仪研磨后，准确称取2 g（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加入10 mL提取溶剂（分别考察体积分数6%高氯酸、体积分数10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和体积分数5%三氯乙酸的提取效果），选用合适的提取方式提取20 min（分别考察匀浆、超声、振荡、添加陶瓷均质子涡旋4 种提取方式的提取效果），以12 000 r/min离心4 min，将上清液转移至另一离心管中，于残渣中再加入10 mL提取溶剂，重复以上步骤，合并2 次提取溶液，用5.0 mol/L及0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值（分别考察将pH值调节至4.5、5.0、5.5、6.0时的效果），待净化。

1.3.2 净化

取提取液5 mL至净化柱（分别考察PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 种净化方式的效果），收集净化液于10 mL接收管中，涡旋0.5 min，过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱-质谱测定。

1.3.3 溶液配制

标准储备溶液：分别准确称取固体标准物质AMP、IMP、I、Hx各10 mg，分别置于4 个50 mL烧杯中，Hx先用2 mL 0.5 mol/L硫酸溶液促进溶解，其他物质加适量的一级水溶解，并用一级水转移并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，配制成质量浓度为100 ?g/mL的单标储备液，4 ℃冰箱中避光保存。

混合标准溶液：分别吸取各单标储备液适量，用一级水配制成各物质质量浓度梯度为50、100、200、500、1 000 ng/mL的混合标准工作溶液。

1.3.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱：SB-Aq RRHD柱（3.0 mm×100 mm，1.8 ?m）;柱温30 ℃;进样体积2 μL;流动相A：甲酸-水溶液（1∶99，V/V）;流动相B：乙腈;流速0.3 mL/min。洗脱梯度见表1。

质谱条件：电喷雾（electrospray ionization，ESI）离子源，正离子模式，毛细管电压2 800 V，干燥气流速11 L/min，喷针气压力241 kPa（35 psi），离子源温度270 ℃，鞘气流速10 L/min，鞘气温度300 ℃，多反应监测模式参数见表2。

1.3.5 结果计算

样品中4 种化合物含量用下式计算。

式中：X为样品中目标化合物含量/（mg/kg）;C为由标准工作曲线拟合得到的样品提取液中目标化合物含量/（ng/mL）;V为最终定容体积/mL;n为样品处理过程中的稀释倍数;m为样品质量/g。

1.4 数据处理

数据处理采用Microsoft Excel 2017软件;化学结构式采用Chemsketch软件绘制;柱状图采用Originpro 8.5软件绘制。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

作为化合物分析的第1步，选择合适的提取溶剂，将目标物从样品基质中高效、快速地提取出来非常重要[29-30]。

本研究选择体积分数6%高氯酸、体积分数10%甲醇水溶液、3%高氯酸+10%甲醇水溶液和体积分数5%三氯乙酸作为提取溶剂，分别考察4 种溶剂的提取效果。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。

对比使用不同提取溶剂、加标量为100 ng/mL时的加标回收率。由图2可知，用10%甲醇水溶液作提取溶剂时，IMP、I和Hx的加标回收率都在90%以上，但AMP没有响应，这可能是由于AMP含有氨基，需要提供更多的H+使其发生电离。另外3 种提取溶剂中，使用3%高氯

酸+10%甲醇水溶液时，4 种目标化合物的加标回收率都在85%左右，最高达到88%。使用6%高氯酸和5%三氯乙酸时，4 种目标化合物的加标回收率均不到80%，因此选用3%高氯酸+10%甲醇水溶液作提取溶剂。

2.2 提取方式的选择

鸡肉中脂肪和蛋白质的含量都很高，在提取过程中对化合物的提取效率会有一定影响。选择合适的提取方式，减小基质对于化合物的干扰很有必要。本研究考察常见的4 种提取方式：12 000 r/min转速下匀浆5 min、超声波提取仪中超声20 min、振荡器振荡30 min、添加陶瓷均质子涡旋20 min，由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。

对比不同提取方式、加标量为100 ng/mL时的加标回收率。由图3可知，通过匀浆提取的效果最差，加标回收率为75%左右，且相对标准偏差较大，接近2%。通过振荡提取的加标回收率为80%左右，通过超声提取的加标回收率为85%左右，振荡和超声提取的相对标准偏差均约为1%。添加匀浆均质子涡旋的提取效果最好，加标回收率为90%以上，最高达93%，且相对标准偏差小，约为0.5%，因此提取方法选用添加匀浆均质子涡旋。

2.3 提取液最适pH值的选择

pH值对分析物保留时间和分离效果影响很大，比较不同pH值提取液对目标化合物分离的影响。

由图4可知，当提取液pH值为5.5和6.0时，加标回收率均在80%以下，当提取液pH值为4.5时，加标回收率为81%～87%，当提取液pH值为5.0时加标回收率最高，平均值为91.3%。可能是由于pH值影响目标物质在质谱仪中的电离效果，在pH值为5.0时电离最完全，故选取pH 5.0作为提取液的最适pH值。

2.4 净化方式的选择

样品经过提取后，上清液中还含有大量油脂，油脂分子质量较大，在流动相中流动缓慢，极易堵塞色谱柱，另外油脂和蛋白质对4 种目标物的检测产生基质干扰，降低方法的灵敏度。为了能有效对鸡肉样品进行净化和富集，除去油脂、蛋白质等基质干扰，选择合适的净化方式也十分有必要。本研究选择PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS法、MCX柱3 种方式对样品进行净化。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含目标物对实验结果造成的影响。

对比不同净化方式、加標量为100 ng/mL时的加标回收率。由图5可知，用QuEChERS法和MCX柱净化时的加标回收率均不到90%，相对标准偏差为0.6%～0.9%。用PEIME HLB柱净化时，平均加标回收率达90%以上，相对标准偏差最高只有0.4%，故选取PEIME HLB柱作为净化方式。

2.5 色谱条件优化

在周俊华等[29]的研究基础上，选择乙腈和甲酸水溶液作为流动相，比较Hilic Plus柱、C18柱和SB-Aq柱3 种色谱柱对4 种化合物的分离效果。由图6可知，由于4 种化合物均为极性化合物，在C18柱上保留较弱，易受到杂质的干扰，目标化合物与杂质不能达到有效分离。Hilic柱可以将4 种化合物分离，但分离度不佳、整体响应不高。SB-Aq柱可将4 种化合物有效分离且峰形对称、尖锐，各物质分离度及响应都较Hilic Plus柱高，因此选用SB-Aq柱作为分析色谱柱。考虑到样品基质的复杂性，在后续研究中，选择梯度洗脱来改善分离效果。

2.6 质谱条件优化

AMP、IMP、I中连接碱基与戊糖的糖苷键在酸性条件下不稳定，容易断裂得到带正电荷的基团，在正离子模式下灵敏度较高，因此选取ESI+模式进行检测。

在ESI+模式下，通过直接进样法，优化各化合物的质谱条件，然后通过全扫描模式，得到化合物[M+H]+准分子离子峰，以此作为它们的母离子。在此基础上，通过子离子扫描寻找子离子，选择2 个丰度较高、本底噪音较低的子离子，并优化去簇电压和碰撞能量，最终选定定量分析条件。各化合物的保留时间、母离子、主要碎片离子、最佳碰撞电压和去簇电压详见表2。定性、定量离子流图见图7，检测样品时，通过质谱仪将母离子打碎成相对应的子离子，且相对丰度与图7一致时，则可确定存在此化合物。

2.7 方法学考察

2.7.1 线性关系、检出限及定量限

利用逐级稀释法向样品中添加混合标准溶液，配制成AMP、IMP、I、Hx质量浓度梯度均为50、100、200、500、1 000 ng/mL的基质标准溶液，在选定的前处理和仪器条件下进行测定。以3 倍信噪比确定检出限，10 倍信噪比确定定量限。

由表3可知，该方法在50～1 000 ng/mL范围内线性良好，4 种目标化合物相关系数均大于0.996，AMP检出限和定量限分别为0.05、0.20 mg/kg，IMP检出限和定量限分别为0.02、0.10 mg/kg，I和Hx检出限和定量限均分别为0.03、0.15 mg/kg。

2.7.2 稳定性实验

取2 g鸡肉样品，按照选定的前处理方法进行处理，将所得溶液按照选定的仪器方法于放置0、2、4、6、8、10、12 h进样测定。由表4可知，4 种目标化合物含量测定的相对标准偏差为0.3%～0.8%，表明样品溶液在12 h内稳定。

2.7.3 加标回收率和精密度实验

称取鸡肉样品6 份，每份2.0 g，向样品中分别添加不同质量浓度的混合标准溶液，使加标量分别为0.25、1.00、5.00 mg/kg，按照选定的前处理方法和仪器方法进行加标回收率和精密度实验。

由表5可知，在3 个加标水平下，4 种目标化合物的加标回收率为79.63%～91.08%，相对标准偏差均小于5.0%，表明所建立的方法准确度较好，能满足鸡肉中4 种目标化合物含量测定要求。

3 结 论

建立鸡肉中AMP、IMP、I、Hx 4 种化合物的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。在优化条件下，4 种化合物得到有效分离，基线平稳，稳定性好;对样品进行不同水平加标实验，结果表明，回收率较高，精密度较好。该方法简便、可靠、实用性强，适合于鸡肉中AMP、IMP、I、Hx含量的测定。

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收稿日期：2021-07-09

第一作者简介：陈超（1986—）（ORCID： 0000-0001-9176-859X），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品安全检测。

E-mail： 584686214@qq.com

*通信作者简介：李莹莹（1984—）（ORCID： 0000-0002-9677-0397），女，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品安全与真实性分析。E-mail：  ying_sky@126.com