GM-CSF 对猪卵丘细胞扩展相关基因表达的影响

黄国梁，王倩玉，买雨晨，咸承俊，张涛杰

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124）

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种分子量为18～22 kDa 的糖蛋白，通过与其受体GM-CSFR 相结合发挥功能。GM-CSF是主要的造血生长因子之一，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF 通过调控粒细胞、单核巨噬细胞以及激活树突状细胞，在外周组织中发挥功能[1]，也能够刺激骨髓细胞生成粒细胞以及巨噬细胞、T 细胞等免疫细胞的增殖[2]。1994 年，Brannstrom等[3]发现，大鼠卵巢能分泌具有生物活性的GM-CSF，分泌水平在排卵时达到峰值。1996年，Jasper等[4]发现，人类卵泡液中的GM-CSF随着生殖周期的变化而改变，体外培养的颗粒性黄体细胞和卵泡膜性黄体细胞均分泌GM-CSF，表达为其受体GM-CSFRα 和β。在GM-CSF 敲除小鼠的卵巢功能研究中发现，与正常小鼠相比，双敲（GM-/-）妊娠小鼠卵巢中细胞数明显减少，孕酮表达水平降低，表示GM-CSF 影响早期妊娠双敲小鼠（GM-/-）黄体的分泌功能，但不影响卵巢正常功能的发挥[5]。

有研究表明，子宫上皮细胞能够分泌GM-CSF，原位杂交结果证明了子宫内膜上皮和腺上皮是GM-CSF 表达的主要部位。卵巢分泌的生殖激素对GM-CSF 有调节作用，这种雌激素诱导的分泌增加可以通过联合使用孕酮来抑制[6]。在牛的整个发情周期中，输卵管和子宫内膜都可见GM-CSF的表达。可见，GM-CSF是调节胚胎发育的一个重要细胞因子[7]。与正常体型牛相比，GM-CSF 在肥胖牛的输卵管壶腹部的表达较低，可能与其生产的优质胚胎数量较少有关[8]。还有研究发现，在发情周期和妊娠早期的小鼠子宫内膜上皮分泌的GM-CSF，是类固醇激素调节子宫内中性粒细胞、巨噬细胞的激活和募集的重要调控因子[9]。GM-CSF 能够促进小鼠附植前胚胎的发育和存活，可能与其对细胞应激反应和凋亡通路的抑制作用有关[10]。猪胚胎发育过程中，培养基添加2 μg/L 或10 μg/L 的GM-CSF，体外受精与核移植胚胎的囊胚率和囊胚细胞数量均明显增加，在囊胚期移植后经过GM-CSF处理的胚胎可成功进行核移植[11]。GM-CSF受体α和β在牛的卵丘细胞和卵母细胞上均有表达，可提高卵丘细胞扩展率[12]。试验旨在研究猪卵母细胞体外培养过程中，GM-CSF对卵母细胞的极体排出率、卵丘细胞的扩展率的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

重组GM-CSF（北京中科拜克生物技术有限公司）、M199 培养基（GIBCO）、CCK-8 检测试剂盒（日本同仁）、M199基础培养液（Biosharp）。

1.2 药品配制

捡卵液（M199 基础培养液28 mL+200 μL 肝素钠储液），洗卵液（M199基础培养液2 mL+胎牛血清100 μL，试验前2 h配好放入恒温箱平衡）

成熟培养液配制：M199 基础培养液730 μL+双抗（100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 硫酸链霉素）+10 μL 葡萄糖储液(0.55 g/mL)+10 μL NaHCO3储液（0.03 g/mL）（SIGMA V900182）+10 μL 丙酮酸钠储液（0.03 g/mL）(EKEAR SO131）+10 μL PVA 储液（0.01 g/mL）（EKEAR P0207）+l-半胱氨酸储液（0.07 g/mL）（SIGMA c7352-100G）+4%胎牛血清（Biosharp）

试验前2 h 配好放入恒温箱平衡。试验开始前添加10 IU/mL PMSG（北京索莱宝科技有限公司）+10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素HCG（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 卵母细胞体外培养

1.3.1 卵母细胞的收集

猪卵巢无菌采集于兰州市榆中县生猪屠宰场，选择9 头6～7 月龄健康长白猪卵巢，将采集到的卵巢保存于PBS缓冲液中，2 h内带回实验室。37 ℃恒温捡卵，选择胞质均匀、颜色较深、颗粒细胞包裹紧密、达3 层以上的COC，在洗卵液、成熟液中各冲洗2次备用[13]。

1.3.2 成熟液的分组

将获取的猪卵泡卵母细胞置于35 mm胚胎培养皿中，做成3个200 μL的微滴，随后覆盖石蜡油。每个液滴中放入30～40个卵母细胞，每皿1组，随机分为3组，每组3个试验重复。试验组1 为成熟培养液；试验组2 为成熟培养液中添加10 μg/L 的GM-CSF；试验组3 为成熟培养液中添加100 μg/L的GM-CSF。

1.3.3 卵母细胞成熟培养

洗涤后的卵母细胞放入38 ℃、5%CO2饱和温度条件培养48 h，进行机体排出率和卵丘扩展情况的统计，并收集卵丘细胞进行检测。

1.4 试验方法

按照CCK8 检测试剂盒说明，将在成熟培养液中培养12、24 及48 h 的COC 上的卵丘细胞吹下，接种于96 孔板中。每孔加入100 μL 的卵丘细胞至含4%胎牛血清的培养液中，在二氧化碳培养箱中37 ℃培养24 h后加入10 μL CCK8 检测试剂，培养箱中孵育2 h 至培养液显色为粉红色，并设空白对照组，在酶标仪中检测OD 值。OD 值按照试剂盒提供的细胞活力计算方法进行计算并统计。

1.5 数据统计与分析

采用Graph Pad Prism 8 软件进行差异显著性分析和制图，基因表达与蛋白表达的组间差异性分析采用t检验，各级卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率统计采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞判定（见图1）

图1 卵丘细胞扩展程度分级及成熟卵母细胞形态Fig.1 Scale of cumulus cell expansion and morphology of mature oocytes

倒置显微镜下将卵母细胞的按卵丘扩展程度进行分类。由图1（a）可知，0 级为卵母细胞的卵丘细胞脱落退化；由图1（b）可知，1 级为卵母细胞的卵丘细胞只有一层或最外围扩散，卵丘细胞少且不均匀；由图1（c）可知，2 级为卵母细胞的卵丘细胞的外层出现扩散，层数增多，卵丘细胞包裹紧密颜色深；由图1（d）可知，3 级为卵母细胞的卵丘细胞除放射冠外开始全部扩散，卵丘细胞颜色较浅，胞质均匀；由图1（e）可知，4 级为卵母细胞的卵丘细胞全部扩散；由图1（f）可知，吹打下卵丘细胞，观察成熟卵母细胞，卵黄间隙上出现极体即可判定为成熟。

2.2 GM-CSF 对卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟的影响（见表1）

由表1 可知，卵丘扩展程度为3～4 级的卵丘细胞百分数在各组别间差异性显著（P<0.05）。

表1 卵丘细胞扩展和卵母细胞极体排出率Tab.1 Cumulus cell expansion and oocyte polar body excretion rate 单位：%

2.3 GM-CSF对卵丘细胞活性的影响（见图2）

图2 GM-CSF对卵丘细胞活性的影响（n=3）Fig.2 Effect of GM-CSF on cumulus cell activity(n=3)

将含有不同浓度GM-CSF 的COC 培养12、24、48 h后，放入0.2%透明质酸的M199 培养液中，于培养箱中孵育5 min，使用10 μL 移液枪轻轻吹打COC。将脱落下来的卵丘细胞1 500 r/min 离心收集，加入4%胎牛血清后均匀注入96孔板中培养24 h，再加入CCK-8进行活性检测，每组试验均设3 个重复。由图2 可知，不同培养时间的GM-CSF 组细胞活性均高于对照组，且48 h 时，10、100 μg/L 的GM-CSF 组细胞活性极显著高于对照组（P<0.01）。

3 讨论

通过组织学定位发现，GM-CSF受体在牛卵巢中可与颗粒细胞孕酮分泌的相关蛋白3β-HSD 及卵泡刺激素FSHR 在牛卵巢中共表达，暗示其可能对颗粒细胞的激素分泌功能有影响。体外培养卵巢颗粒细胞中，添加GMCSF可以增加颗粒细胞2-脱氧葡萄糖（DOG）或3-O-甲基葡萄糖（OMG）的吸收，暗示其可调节牛卵巢颗粒细胞糖代谢的活性[11]。在关于牛卵丘细胞的研究中发现，体外培养的卵母细胞在SOF培养基中添加0、1、10和100 μL的人重组GM-CSF，22 h后分析扩展指数（CEI）和极体排出率，发现GM-CSF 受体在卵丘细胞和卵母细胞中均出现，10 μg/L 和100 μg/L 组扩展指数为0.8 和1.22，高于0.22 的对照组。但极体排出率没有明显差异。100 μg/L 组的卵丘细胞生存率比对照组高出20%，且差异极显著。且10 μg/L 和100 μg/L 增加卵丘细胞数量分别为20%和50%。而GM-CSF特异性抑制剂IP3细胞因子对以上差异均有抑制作用[13]。GM-CSF 对体外培养卵丘细胞和卵母细胞的代谢有显著影响[14]。

文献报道，排卵前卵泡及多囊卵泡综合征患者卵泡液中均含有GM-CSF[4,15-16]。试验在未添加猪卵泡液（PFF）的情况下，10 μg/L 组与100 μg/L 组的GM-CSF 对卵丘细胞扩展均具有明显的促进作用，且主要提高扩展程度较高的3～4 级卵丘细胞，对扩展程度较低的0～2 级卵丘细胞的扩展无明显作用，说明GM-CSF 对卵丘细胞的扩展与COC 的自身状态有关，即GM-CSF 能促进质量较好的COC 的卵丘细胞扩展，但不能逆转质量较差的卵丘扩展。GM-CSF 虽然能提高3～4级卵丘细胞的扩展数，但对极体排出及卵母细胞成熟率无显著影响。孙兴参等[17]研究猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟的关系，发现卵丘细胞扩展充分与否与卵母细胞核成熟无显著相关，在去除卵母细胞的COC 中，卵丘细胞的扩展不受卵母细胞的影响，说明卵丘细胞扩展与否并不对卵母细胞成熟起决定作用，GM-CSF对卵母细胞成熟没有显著促进作用，与Oscar 等[12]在牛卵丘细胞扩展中得出的结论一致。

本试验中，分别对COC 中GM-CSF 孵育12、24、48 h的卵丘细胞的细胞活性进行检测，结果表明，3个时间段的细胞活性在10 μg/L 组与100 μg/L 组均有所提高，作用48 h后的细胞活性组间差异显著（P<0.05）。

4 结论

GM-CSF 能够显著提高3～4 级猪卵丘细胞扩展率及卵丘细胞的活性。