地黄饮子“异病同治”阿尔茨海默病和帕金森病网络药理学及分子对接研究

刘宁，刘毅，秦亚莉，韩诚，闫川慧，贺文彬

1.山西中医药大学附属医院，山西 太原 030024；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森病（Parkinson disease，PD）是神经退行性疾病的典型代表。目前认为，AD的病理特征是光镜下脑神经细胞外出现β淀粉样蛋白（β amyloid，Aβ）沉积形成的老年斑（senile plaques，SP）和细胞内Tau蛋白异常磷酸化，以及由此引发的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）和大脑新皮层及海马突触丢失、神经炎症、神经细胞的死亡[1]；PD的发病机制倾向于黑质纹状体多巴胺神经元的变性坏死，并且出现含有嗜酸性的路易小体[2]。中医学认为，二者基本病机均为“肾虚髓空”，并据此指导临床治疗。本课题组前期研究显示，地黄饮子干预AD和PD的方证效应机制可能与泛素蛋白酶体系统衰退有关[3]。

地黄饮子出自《圣济总录》，由熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志共12味药组成，有滋肾阴、补肾阳、化痰开窍之功。方中熟地黄、山茱萸滋阴填精益髓、滋补肾阴，肉苁蓉、巴戟天温肾壮阳，温而不燥，四药相配，阴阳并补，培补下元虚衰，共为君药；附子、肉桂大辛大热，益火助阳，协助肉苁蓉、巴戟天补肾壮阳以温下元，摄纳浮阳并引火归元，石斛、麦冬、五味子滋养肺肾，为臣药；石菖蒲与远志、茯苓合用，化痰开窍，为佐药；另以姜、枣和中为使。全方阴阳双补，上下同治，以培补下元虚衰之本为主，兼化痰开窍，可谓标本兼顾。中药方剂具有多成分、多靶点、多通路发挥作用的特点，本研究通过网络药理学对地黄饮子“异病同治”AD、PD的相关生物学机制进行阐释，为中医“异病同治”理论提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分筛选及靶点匹配

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索熟地黄、巴戟天、山茱萸、肉苁蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、石菖蒲的化学成分。通过中国知识资源总库（CNKI，https://www.cnki.net/），主题检索2015年1月1日－2020年12月1日文献中远志、石斛、麦冬的化学成分。通过SwissADME平台（http://www.swissadme.ch/）筛选地黄饮子组方药物有效成分，筛选条件：胃肠道吸收（GI absorption）为高（High）、血脑屏障渗透（BBB permeant）为是（Yes）、类药性（Drug likeness）大于2个符合（Yes）。筛选出的有效成分结合TCMSP和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）得到相关靶点，并通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）匹配靶点基因名。

1.2 疾病靶点获取

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库分别检索“Alzheimer Disease”“Parkinson’s Disease”，得到AD、PD相关疾病靶点，并将3个数据库所得靶点分别合并、去重，再利用UniProt数据库匹配已验证的人类靶点基因名。

1.3 药物-疾病交集靶点获取

利用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）将地黄饮子药物靶点分别与AD、PD相关疾病靶点取交集，获得地黄饮子有效成分直接与疾病相关的靶点。

1.4 疾病-药物-成分-靶点网络及蛋白相互作用网络构建

以疾病、地黄饮子、组方药物、药物有效成分及其相关靶点为节点，以各节点间相互关系为边，利用Cytoscape3.8.0构建疾病-药物-成分-靶点网络，并根据网络中节点的Degree值筛选关键成分。利用STRING数据库（https://string-db.org/）构建药物-疾病交集靶点蛋白相互作用（PPI）网络，对PPI网络进行拓扑分析以筛选关键靶点。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

将药物-疾病交集靶点导入Cytoscape3.8.0的BiNGO、ClueGO插件，分别进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并进行可视化。

1.6 关键成分与关键靶点分子对接

选取疾病-药物-成分-靶点网络的关键成分及药物-疾病交集靶点PPI网络的关键靶点，分别在Zinc（https://zinc.docking.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）数据库中获取3D结构，并使用Vina进行分子对接，将其中对接最好的组合使用Pymol进行可视化。

2 结果

2.1 药物有效成分和对应靶点

通过TCMSP、CNKI检索及筛选，获得地黄饮子有效成分127种（重复成分10种），其中熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麦冬、石菖蒲、远志分别为2、12、14、19、5、7、8、0、6、15、2、37种。结合SwissTargetPrediction，得到药物靶点926个。

2.2 疾病靶点

通过GeneCards数据库得到AD相关靶点9 554个、PD相关靶点7 657个，以相关度大于中位数进行筛选，分别获得AD、PD靶点4 780、4 362个；此外，OMIM、TTD数据库分别得到AD靶点305、29个，PD靶点367、23个。将以上所得靶点分别合并、去重，通过UniProt数据库匹配已验证过的人类靶点，共获得AD疾病靶点4 523个，PD疾病靶点3 733个。

2.3 药物-疾病交集靶点

将药物靶点与疾病靶点取交集，获得地黄饮子分别与AD、PD直接相关的交集靶点653、466个。

2.4 疾病-药物-成分-靶点网络和交集靶点蛋白相互作用网络

利用Cytoscape3.8.0构建疾病-药物-成分-靶点网络，结果见图1。网络中Degree＞100的12个关键成分分别为槲皮素、l4-(4-羟基苯乙基)-2,6-二甲氧基苯、l3-O-甲基槲皮素、2-羟基-4,6-二甲氧基二苯甲酮、1,7-二甲氧基-2,3-亚甲基二氧杂蒽酮、4-(3,5-二甲氧基苯乙基)苯酚、对羟基苯乙基阿魏酸酯、N-对香豆酰酪胺、5-羟基-3,7-二甲氧基-1,4-菲醌、1,2,3,6,7-五甲氧基呫吨酮、激肽原A、甲基对苯二酚B。将药物与AD、PD的交集靶点分别导入STRING数据库构建PPI网络，通过CytoNCA插件分析网络并限定DC、BC、CC、NC、LAC值均大于等于4倍中位数，得到PPI核心网络，网络节点即关键靶点，见图2。

图1 地黄饮子治疗AD、PD疾病-药物-成分-靶点网络

图2 地黄饮子治疗AD、PD交集靶点PPI网络

2.5 GO和KEGG富集分析结果

将药物-疾病交集靶点导入BiNGO，设定置信水平为0.01，进行GO富集分析，结果见图3。GO生物过程（biological process）主要包括生物反应、对刺激的应答、细胞过程、信号过程、代谢过程等，GO分子功能（molecular function）包括结合、催化活动、分子转运活动、电荷转运活动等，GO细胞组分（cellular component）以细胞成分、突触成分、细胞外域等为主。将交集靶点导入ClueGO，设定P value≤0.005、最小聚类为30、K-score为0.55，进行KEGG通路富集分析，结果见图4。AD主要通路有TNF信号通路、神经营养信号通路、雌激素信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等，PD主要通路有TNF信号通路、神经营养信号通路、甲状腺激素信号通路、胰岛素抵抗、流体剪切应力和动脉粥样硬化。

图3 地黄饮子治疗AD、PD交集靶点GO富集分析结果关联图

图4 地黄饮子治疗AD、PD交集靶点KEGG通路富集分析结果

2.6 分子对接结果

关键靶点和关键成分分子对接结合能大多低于-5.0 kcal/mol，提示关键成分均可与关键靶点形成稳定结构，见表1。将对接结果最好的关键成分激肽原A与关键靶点PTGS2可视化，二者可通过疏水口袋形成对接，见图5。

表1 地黄饮子治疗AD、PD关键靶点与关键成分分子对接结合能（kcal/mol）

图5 激肽原A与PTGS2分子对接构象图

3 讨论

“异病同治”是中医辨证论治特有的治疗法则，由于证候具有时相性和空间性的特征，一种证候可能存在于多种疾病中，故可以采用相同的方法进行治疗。AD属中医学“呆病”“痴呆”范畴，PD属中医学“颤证”范畴，二者基本病机均为“肾虚髓空”[4]，其发病机制均与神经元凋亡、小胶质细胞的调节作用、miRNA表达、自噬过程的调节作用及P62蛋白的降解作用有密切关系[5]。因此，AD与PD的中医证候和西医病理机制均有共同点，采用相同方药进行治疗有其理论依据，本研究采用网络药理学和分子对接对其进行分析和验证。

地黄饮子治疗AD的临床和基础研究报道多以已知信号通路为切入点[6-8]。张丽等[9]采用地黄饮子治疗AD患者60例，认为其作用机制可能与调节Notch1、ASAM10及BACE1蛋白，降低丙烯醛浓度有关。临床使用地黄饮子治疗PD有显著疗效[10]。现有研究基本围绕氧化应激展开，而针对异常蛋白狙击和神经炎症等研究很少，考虑地黄饮子可能通过抗氧化应激、抑制细胞凋亡、减轻神经免疫炎症反应、抑制蛋白异常聚集、诱导自噬、改善线粒体能量代谢等方面发挥治疗PD的作用[11]。

本研究通过网络药理学分析地黄饮子组方药物有效成分及其作用靶点，得到该方治疗AD和PD的相关信号通路为TNF信号通路和神经营养信号通路。研究显示，神经营养因子（NTs）是一类调节神经元发育、分化及功能的因子，它可激活2种不同类型的受体，包括酪氨酸激酶的Trk家族和肿瘤坏死因子受体超家族中的p75NTR，进而启动复杂的信号转导通路，从而发挥生物学效应[12]。在神经退行性病变中，NTs在神经系统不同部位的表达水平与生理状态下有显著差异，提示NTs的表达与神经退行性变密切相关，如在AD中基底核的前脑基底胆碱能神经元神经生长因子（NGF）表达下降[13-14]，而在AD受累最严重的海马区域额叶皮质区神经元NGF表达上升[15-16]，表现出与病理状态相反的改变。与之不同的是，脑源性神经营养因子（BDNF）在海马区、额叶皮质区和胆碱能神经元聚集区表达水平较高，并起到支持相应脑区神经元存活、促进神经生长及维持突触可塑性的作用[17-18]。项捷[19]研究发现，BDNF减少后，TrkB与Tau相互作用是导致AD发病的重要原因。

NTs作为一个庞大家族，其中的保守性多巴胺神经营养因子家族在PD多巴胺神经元的修复中起到至关重要的作用。林瑶等[20]研究显示，经补肾复方干预后，PD模型大鼠额叶、纹状体的大脑多巴胺能神经营养因子（CDNF）、中脑胶质细胞源性神经营养因子（MANF）蛋白及mRNA表达水平升高，提示补肾复方可能通过增加不同脑区CDNF和MANF的表达发挥神经保护作用，从而防治PD。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接技术阐释地黄饮子“异病同治”AD和PD的分子生物学机制，可为中医“异病同治”理论提供依据，并为AD和PD的精准治疗提供研究思路。