一种通过UHPLC-MS/MS进行漏芦真伪鉴别的方法

孙强，邵立功，刘斌，牛家丰

(1.山东省食品药品审评查验中心,山东 济南 250012；2.泰安市食品药品检验检测研究院，山东 泰安 271000；3.枣庄市食品药品检验检测中心,山东 枣庄 277299)

《中国药典》2015年版中规定[1]漏芦(RadixRhapontici)为菊科植物祁州漏芦的干燥根，祁州漏芦又名为野兰、和尚头、狼头花，是多年生草本植物，广泛分布于中国东北、西北、华中地区。具有清热解毒、消痈、下乳的功效，常用于治疗乳痈肿痛、乳汁不通等妇科病[2]。在漏芦的日常检验中发现多批样品为漏芦伪品大火草根(AnemonetomentosaRoot)或与其掺杂在一起。大火草俗称甘肃白头翁为毛茛科银莲花属多年生草本植物，主要分布在四川、甘肃、河南等地[3]，常用于治疗痢疾、各种顽癣、疮疖痈肿，也可作小儿驱虫药，有一定的毒性。

通常大火草根饮片可以通过性状和显微进行有效的鉴别，但少量混入漏芦中的样品却不易被发现，查询相关文献，没有发现相关鉴别的报道。本文开发了超高效液相色谱-串联质谱法测定大火草根中齐墩果酮酸含量的检测方法，通过该方法能够快速有效的筛查漏芦掺伪的样品或相关中成药样品，为以后漏芦药材真伪鉴别以及相关中成药的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LCMS-8050型超高效液相色谱-串联质谱仪，配岛津LC-30AD超高效输液泵，LC solution工作站；XS205DU十万分之一电子天平(Mettler Toledo)；Milli-Q纯水器(美国密理博公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗仪(昆山舒美)。

1.2 试药 齐墩果酮酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：c03m8q30462)；漏芦对照药材(中检院，批号：121036-201603)；15批漏芦样品在市场采购后，经泰安市食品药品检验检测研究院展雪峰主任药师鉴定后进行编号(1～8号为未掺伪样品，9～11号为掺伪样品，12～15号为伪品)；甲醇(HPLC级别，Fisher Chemical)；水为Milli-Q制水。

2 试验方法

2.1 色谱和质谱条件 色谱柱：Shim-pack FC-ODS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相：甲醇-1.0 mmol·L-1醋酸铵水溶液(85∶15)；流速：0.2 mL·min-1；离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子模式；工作模式：多反应检测模式，MRM参数见表1；雾化气：3 L·min-1；加热气：10 L·min-1；干燥气：10 L·min-1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酮酸对照品适量，分别加甲醇制成质量浓度为512 μg·mL-1的对照品贮备液。精密量取贮备液适量，加甲醇分别制成浓度为2 560、1 280、512、256、128、25.6 ng·mL-1标准曲线对照溶液。

2.2.2 漏芦样品溶液的制备 精密称定漏芦对照药材1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得漏芦供试液。

2.2.3 漏芦根茎溶液的制备 单独挑取2、7号样品中混入的根茎，研细，精密称取1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得漏芦根茎供试液。

2.2.4 漏芦伪品溶液的制备 取伪品研细过三号筛，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得伪品供试液。

3 方法学验证

3.1 专属性考察 分别取空白试剂溶液、漏芦对照样品溶液、漏芦根茎溶液、齐墩果酮酸对照品溶液、漏芦伪品溶液按“2.1”项下色谱和质谱条件进样，TIC结果见图1，MRM色谱图见图2。通过TIC总离子流图可见空白试剂溶液、漏芦对照样品溶液、漏芦根茎溶液没有相关干扰峰，伪品含齐墩果酮酸的定量离子与定性离子与对照品一致。

A.空白试剂溶液(blank sample)；B.漏芦对照药材(reference crude drug of Radix Rhapontici)；C.漏芦根茎(Radix Rhapontici Root and Stem)；D.齐墩果酮酸(oleanonic acid)；E.大火草根(Anemone tomentosa Root)

图2 齐墩果酮酸离子对色谱图

3.2 线性关系、LOD及LOQ 取“2.2.1”项下的标准曲线对照溶液，按“2.1”项下的色谱质谱条件进样进行采集，记录色谱图并计算相应的色谱峰面积。以浓度(ng·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，齐墩果酮酸的回归方程分别为：Y=1.616×105X+0.985×103(r=0.996)。结果表明齐墩果酮酸在25.6～2 560 ng·mL-1范围内线性关系良好。取不含齐墩果酮酸的空白溶液，加入对照品适量按“2.1”项下的色谱和质谱条件进样进行采集，LOD及LOQ分别以三倍S/N和十倍S/N计，其结果分别为0.6、2.0 μg·L-1。

3.3 精密度及重复性试验 取512 ng·mL-1对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，以峰面积考察精密度，齐墩果酮酸的RSD为0.6%；按“2.2.2”项下，平行制备同一样品(编号为11)6份，依上述色谱条件依法进行测定，并分别计算含量，齐墩果酮酸的含量平均值分别为0.66 mg·g-1，RSD为0.6%。

3.4 回收率试验 精密称取11号样品1.0 g，分成9份，分别精密加入对照贮备液0.65、1.3、1.95 mL，照“2.2.2”项下方法制成加样回收供试液，依上述色谱质谱条件依法进行测定，并分别计算回收率，结果见表1。

表1回收率试验结果

3.5 样品测定 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱质谱条件，注入质谱仪，记录色谱图，用外标法计算样品中齐墩果酮酸的含量。结果按1～15编号计分别为1～8号均未检出(低于检出限)、9～11号0.45～0.66 mg·g-1、12～15号0.99～1.27 mg·g-1。

4 讨论

4.1 指标化合物的筛选 漏芦为菊科植物而大火草为毛茛科植物，两个不同科属的植物肯定含有不同化合物，通过对比漏芦和大火草根的化学成分[4-6]，初步筛选出来过氧麦角甾醇、齐墩果酮酸、异秦皮啶等多种化合物。这些化合物均在存在于大火草根中而不存在于漏芦中，可以作为鉴别用的指标性成分。

4.2 检测器的筛选 通过第一步化合物的筛选后进行相关检测器的选择，有些化合物紫外吸收强烈而有的在蒸发光检测器中吸收强度高[7-8]。通过配制混合对照品溶液、漏芦样品和大火草根样品溶液，分别用DAD及ELSD检测器进行检测，通过筛查发现齐墩果酮酸在大火草根的ELSD中的吸收较高而在漏芦中未检出，为了进一步对其进行定性及定量分析故采用高效液相色谱-串联质谱法对其进行测定。

4.3 通过对市场的考察发现，漏芦中掺伪大火草根的情况还是常见的，制定相关检验鉴别的方法是十分必要和重要的。使用本法测定其结果准确性、靶向性高，可有效地控制漏芦的质量，为漏芦药材真伪鉴别及其中成药的掺伪鉴别有一定的借鉴意义。