尖孢镰刀菌HG-11响应解淀粉芽胞杆菌B501胁迫的机制分析

马 佳,胡 栋, 田 硕,2, 彭杰丽, 张翠绵, 贾 楠, 王占武

(1.河北省农林科学院 农业资源环境研究所(河北省肥料技术创新中心)，石家庄 050051;2.河北师范大学 生命科学学院，石家庄 050024)

在生物防治领域，研究重点多集中在生防菌对病原菌的抑菌机制，生防机制主要包括竞争、重寄生、拮抗、抗生和诱导抗性等方面[1]。但病原菌如何抵御有益生防菌的胁迫，如何影响生防效率的机理却常被忽略。如同有益菌有多种机制拮抗病原菌，病原菌同样具有多种反拮抗机制，应答生防菌的胁迫压力。Chen等[2]建立了以“生防细菌-赤霉病菌”为模式的“细菌-真菌”跨界互作研究系统，首次发现生防细菌绿针假单胞菌(Pseudomonapiscium)ZJU60通过分泌抑菌物质吩嗪-1-甲酰胺抑制禾谷镰刀菌的组蛋白乙酰化，进而抑制赤霉病的发生。病原菌对化学杀菌剂产生抗药性已众所周知，同样病原菌是否也对拮抗菌的胁迫产生抗性，其抗性机制如何，需要深入探索。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)属芽胞杆菌属，是生防菌研发的热点[3]，具有抗菌谱广、抗逆性强及生物安全性高等优点。解淀粉芽胞杆菌主要通过分泌次生代谢产物抑制病原菌的生长发育，其次生代谢产物的种类较多，具有抗菌特性的物质主要包括：脂肽类抗生素和抗菌蛋白[4]。脂肽类抗生素(Lipopeptide antibiotic)根据其结构可分为伊枯草菌素(Iturin)家族、表面活性素(Surfactin)和泛革素(Fengycin A、B)[5]。其中表面活性素与细菌生物膜的形成有关，芽胞杆菌能够在植物根系以生物膜形式定殖，并分泌具有杀菌作用的表面活性素[6]。抗菌蛋白包括：抗菌肽、细胞壁降解酶等。芽胞杆菌菌体产生的细胞壁降解酶是一类重要的抗菌蛋白，主要包括几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等以及其他丰富的代谢产物[7]，可抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发。

由致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起的植物枯萎病在全世界十大植物真菌病害中排在第5位[8]。植物枯萎病是一种土传真菌病害，严重感病植株整株枯黄萎蔫，最终枯死，在作物的全生育期内均可发生，给农业生产造成巨大经济损失[9]。由河北省农林科学院农业资源环境研究所农业微生物研究室分离得到的一株解淀粉芽胞杆菌B501，经测定对尖孢镰刀菌HG-11具有较高的抑制效果。在其发酵液处理下，HG-11菌丝生长受到抑制，菌丝肿大变粗，这种形态改变可能是B501产生的抑菌物质对 HG-11作用的结果，而HG-11如何响应或应答B501抑菌物质的毒害并不清楚。

本研究首先检测B501的生物膜、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等生防相关因子，初步了解B501对HG-11的生防机理；然后以B501和HG-11作为生防微生物和植物病原微生物互作系统，采用转录组测序技术比较分析HG-11野生型菌株和经B501发酵液处理后菌株的基因表达特征，并结合B501所具有的生防因子以及可能的抑菌方式进行分析，从而在转录组水平上揭示HG-11对B501胁迫的响应机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 解淀粉芽胞杆菌B501菌株由河北省农林科学院农业资源环境研究所农业微生物实验室保存，尖孢镰刀菌 HG-11由河北省农林科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 主要试剂及培养基 MSgg(Minimal salts glycerol glautamate)培养基用于B501生物膜的培养，固体培养基培养菌落型生物膜，液体培养基培养薄皮型生物膜[10]；淀粉培养基用于检测B501能否产生淀粉酶；1%脱脂牛奶琼脂培养基用于检测B501能否产生蛋白酶；纤维素酶筛选培养基用于检测B501能否产生纤维素酶[11]。

HG-11固体培养采用PDA(Potato dextrose agar)培养基，液体培养采用PDB(Potato dextrose broth)培养液[12]；B501液体培养采用LB(Luria-Bertani)液体培养基[13]，30 ℃发酵培养 24 h，8 000 r/min离心5 min，经0.22 μm无菌过滤器过滤所得即为发酵液。

1.2 B501对尖孢镰刀菌HG-11菌丝生长的抑制

在 PDA平板中间接种直径 5 mm 的HG-11菌饼，距离菌饼中心2.5 cm 处对称放置4 张直径6 mm 的小滤纸片，每张纸片上滴加10 μL B501菌液，对照滴加10 μL无菌水，30 ℃培养，5 d后观察分析菌落形态，每个处理重复 3 次。

1.3 B501生防相关因子的测定

1.3.1 生物膜的检测 将活化24 h的B501单菌落接种到LB液体培养基里，30 ℃、180 r/min振荡培养过夜，将过夜摇瓶培养的发酵液按 1∶1 000比例加入到含有MSgg培养基的12孔组织培养板中，在23 ℃下培养，3 d后观察B501生物膜的形成情况。薄皮型生物膜和菌落型生物膜检测各3个重复。

1.3.2 淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的检测 参考李洪涛[11]的方法。

1.4 B501发酵液对HG-11菌丝形态及基因表达的影响

将1 mL 浓度为 1×107个/mL HG-11分生孢子接入100 mL PDB中，28 ℃、200 r/min 振荡培养，3 d后加入5 mL B501发酵液，继续振荡培养48 h，菌丝置于400倍放大的光学显微镜下(ZEISS Primo Star, 德国)观察，当菌丝肿大变粗变形后收集菌丝，用液氮速冻后放置-80 ℃超低温冰箱中保存。B501发酵液处理的样品标记为B501，对照处理只加入LB培养液，样品标记为CK，两组处理分别收集3份菌丝样品。

1.5 HG-11菌丝转录组测序

采用Trizol试剂(Invitrogen, 美国)从处理样品中提取total RNA，利用Nanodrop 2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测。从总RNA中分离出mRNA，通过Oligo(dT)磁珠富集总RNA中带有polyA结构的mRNA，mRNA经离子打断的方式被打断为长度300 bp左右的片段。以RNA为模板，用六碱基随机引物和逆转录酶合成cDNA第1链，再以cDNA为模板进行第2链cDNA的合成。建库试剂盒采用VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(诺唯赞NR611，中国)。通过Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质检，文库大小450 bp，再对文库总浓度及文库有效浓度进行检测。样品经过RNA抽提、纯化、建库之后，采用第2代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)，基于Illumina HiSeq测序平台(Illumina nova seq 6000)，对这些文库进行双末端(Paired-end，PE)测序[14]。

1.6 差异基因表达分析

以FPKM(Fragments per kilobase million)表示基因的表达量。使用转录组表达定量软件RSEM，以转录本序列为参考，通过测序深度和基因长度计算每个基因的FPKM值。B501处理组样品和CK样品间的差异表达基因(DEGs)通过DESeq进行分析，DEGs的筛选条件为：表达差异倍数|lbFoldChange|> 1，显著性P值<0.05。

1.7 GO分类注释和KEGG注释富集分析

使用topGO进行Gene Ontology(GO)富集分析，应用超几何分布方法计算P值，显著富集的标准为P值<0.05，确定差异表达基因显著性富集的GO功能分类。根据差异表达基因的Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)富集分析结果，筛选P值最小，即富集最显著的途径进行分析[15]，找出差异显著性富集的生化代谢途径和信号转导途径。

2 结果与分析

2.1 B501对HG-11菌丝生长的抑制

通过对峙培养的方法，发现B501对HG-11产生的抑菌圈清晰，明显抑制HG-11菌落扩展(图1)。通过400倍的显微镜观察发现，经 B501发酵液处理12 h后的HG-11菌丝膨大，变粗，扭曲，不能进一步延伸生长，对菌丝的形态有很大的破坏作用。而在对照PDB液体培养基中生长4 d的HG-11菌丝形态正常(图2)，这表明B501产生的抑菌活性物质造成HG-11菌丝形态的改变。

2.2 B501生防因子的检测

空气-液体交界面薄皮型生物膜培养法是实验室常用的体外模拟生物膜形成的方法之一，该法主要用以芽胞杆菌(Bacillusspp.)生物膜的研究；生物膜菌落培养法在固体平板表面形成的菌落形态和立体结构，也被认为与细菌的生物膜形成能力密切相关，这两种方法常用于实验室模拟天然生物膜简单模型的建立[16]。检测发现B501在MSgg固体培养基上形成粗糙细致的菌落形态，也能在MSgg培养液的空气-液体交界面形成致密、厚实的脉络式薄皮状生物膜。培养基表面形成复杂的菌落结构作为评价菌株生物膜形成能力的标准之一，前期有研究表明芽孢杆菌生物膜形成能力与防病效果呈正相关，因此B501具备一定的生防能力。在纤维素酶和淀粉酶检测中，菌落周围都出现清晰的透明圈且透明圈直径较大，说明B501能产生纤维素酶和淀粉酶，对纤维素和淀粉的分解能力较强；而蛋白酶的透明圈不明显，则说明B501对蛋白质的分解能力较弱或可能不产生蛋白酶(图3)。

2.3 HG-11受B501胁迫的基因表达特征

为了揭示HG-11受到 B501胁迫后基因表达特征的变化，收集B501发酵液处理48 h 的HG-11菌丝样品(B501)和相同培养条件的未处理的HG-11菌丝对照样品(CK)，分别提取总RNA，反转录成cDNA，构建文库后进行转录组测序。经RSEM软件计算基因的表达水平后，各样品中基因表达量如图4。通过比较两组处理HG-11菌丝样品的转录组FPKM密度分布图发现，B501处理组样品和CK样品的基因总体表达量在离散度和总体分布度上存在一定差异(图4)，表明HG-11在拮抗菌的胁迫处理下，部分基因的表达发生改变。

CK样品共检测到13 423个基因表达，而 B501处理组样品共计13 118个基因表达，其中两个样品间共同表达的基因为11 461个。CK样品特异表达的基因为1 961个，B501处理组样品特异表达的基因为1 656个。使用DESeq2对样品间差异表达基因进行检测，按照差异显著性标准进行筛选，统计基因显著性差异表达上、下调情况。相比CK样品，B501处理组样品中3 171个基因差异表达显著，其中2 106个基因上调表达，1 065个基因下调表达(图5)，显著上调差异表达基因多于显著下调差异表达基因。

将差异基因按照其功能进行GO功能注释，包括细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物学过程(biological process)3 个基本分类。在此基础上将每一类进行细分，又可以分为30个小类，其中在细胞组分类别中涉及基因最多的为细胞膜组分，分子功能类别中涉及基因最多的为跨膜转运活性和核糖体的结构组成，生物学过程类别中涉及基因最多的为跨膜转运和线粒体翻译。在上调表达基因中，参与膜构成、P-P-键-水解驱动的跨膜转运蛋白、甾醇3-β-葡萄糖基转移酶、氧化还原酶、核糖体蛋白复合物、异柠檬酸脱氢酶、蛋白质代谢等的基因表达较显著。解淀粉芽孢杆菌能产生重要的酶系，包括降解多糖的酶类，如α-淀粉酶、纤维素酶、β-1，3-1，4-葡聚糖酶、木质纤维素降解酶、褐藻胶裂解酶和壳聚糖酶；也包括分解蛋白的酶类，如蛋白酶、溶栓酶和凝乳酶[7]。这意味着HG-11可能通过增加细胞膜合成途径相关酶类基因的表达，以应对B501胁迫。下调表达基因主要参与酰基转移酶、DNA连接酶、硫胺素代谢、催化酶、萜类生物合成等过程(图6)。

2.4 转录组差异表达基因比较分析

2.4.1 HG-11细胞壁合成相关基因 芽胞杆菌产生纤维素酶，能够作用于真菌细胞壁，抑制细胞壁合成，降解细胞壁纤维素成分，造成细胞壁强度减弱，细胞在内含物渗透压作用下扭曲变形[17]。本研究中B501处理组样品的菌丝肿大变粗，表明HG-11菌丝细胞壁受到破坏，可能与B501产生的纤维素酶有关。B501处理组样品中的上调表达基因TRINITY_DN67_c0_g1(P=3.15×10-4)，注释为脂糖基化，甾醇3-β-葡萄糖基转移酶，UDP糖基转移酶，与葡聚糖合成相关(表1)。该基因参与有机羟基化合物代谢过程，真菌细胞壁半纤维素木聚糖的生物合成[18]，因此推测该基因可能参与菌丝细胞壁的合成。上述结果表明，HG-11可能通过上调葡聚糖合成途径的基因，提高葡聚糖或细胞壁的稳定性，应对B501纤维素酶的胁迫。

2.4.2 HG-11细胞膜合成和稳定性相关基因 已知解淀粉芽胞杆菌的抗菌物质一般作用于真菌细胞壁、细胞膜，通过破坏细胞壁及细胞膜的结构抑制真菌生长[19]，因此，HG-11细胞膜结构相关基因也是差异基因分析的重点。在B501处理组样品中，TRINITY_DN17937_c0_g1基因上调表达(P=3.88×10-4)，该基因参与细胞内固醇转运，同时与膜转运相关的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上调表达(P=2.03×10-9)，麦角固醇是真菌细胞膜重要组成成分，说明可能是HG-11通过促进麦角固醇生物合成以及调整细胞膜的流动性，来抵抗芽胞杆菌环脂肽类抗菌物质的伤害作用。TRINITY_DN19134_c1_g2基因表达上调(P=1.28×10-3)，该基因注释为膜靶向共翻译蛋白，参与HG-11细胞膜的合成(表1)，说明HG-11通过促进与细胞膜相关的蛋白表达，来抵抗芽胞杆菌抗菌物质的伤害作用。

脂肪酸是细胞膜磷脂的重要组成成分，影响细胞膜的稳定性。B501处理组样品中直接参与脂肪酸合成的2个相关基因TRINITY_DN13494_c0_g1(P=0.036)和TRINITY_DN18207_c0_g4(P=0.036)，前者注释为脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase)，后者注释为脂酰辅酶A，参与脂肪酸的活化。脂肪酸生物合成过程的4个相关基因TRINITY_DN10179_c0_g1(P=0.011)、TRINITY_DN13494_c0_g1(P= 0.036)、TRINITY_DN18061_c0_g3(P=0.048)和TRINITY_DN9445_c0_g1(P=0.002)表达量显著升高。TRINITY_DN18061_c0_g3编码脂肪酸合成酶β亚基，TRINITY_DN13494_c0_g1基因编码酰基辅酶A氧化酶，是脂肪酸β-氧化中的关键酶。TRINITY_DN10179_c0_g1和TRINITY_DN 9445_c0_g1参与细胞内脂质的合成和代谢过程(表1)。这6个基因在发酵液处理的HG-11上调表达可能也是协同缓解芽胞杆菌环脂肽类抗菌物质对细胞膜的伤害。此外，KEGG 注释的差异表达基因中参与的脂质代谢途径较为显著(rich_factor 为0.33；Q 值为0.006)(图7)。这反映出脂肪酸可能在HG-11抵抗芽胞杆菌环脂肽类抗菌物质伤害中起着重要作用。

2.4.3 HG-11细胞器合成和稳定性相关基因 核糖体和线粒体是细胞中两个重要的细胞器，核糖体的主要功能是将遗传密码转换成氨基酸序列并从氨基酸单体构建蛋白质聚合物[20]。线粒体通过三羧酸循环与氧化磷酸化进行能量转化，产生ATP，供给细胞能量。KEGG 注释的差异表达基因中参与的核糖体功能途径最为显著(rich_factor 为0.28；Q 值为0.0007)(图7)。B501处理组样品上调表达基因TRINITY_DN19037_c0_g2(P=1.20×10-12)编码酰胺生物合成，对细胞内核糖核蛋白复合物的合成有重要作用。该基因上调说明HG-11通过促进与核糖体相关的蛋白表达，来抵抗芽胞杆菌抗菌物质的伤害作用。B501处理组样品上调表达基因TRINITY_DN11875_c0_g1(P=0.017)注释为线粒体基因，参与线粒体的合成，TRINITY_DN18930_c1_g1(P=1.48×10-7)基因编码异柠檬酸脱氢酶，在三羧酸循环中将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸，对细胞的能量代谢、生物合成以及抗氧化胁迫起重要作用。TRINITY_DN16521_c0_g1(P=0.015)基因编码细胞色素C氧化酶，细胞色素C氧化酶是线粒体呼吸链的终端酶，在机体内氧化代谢和ATP合成中起重要作用。TRINITY_DN18728_c0_g5(P=1.30×10-2)基因编码钙离子结合蛋白，参与线粒体储存钙离子途径，从而控制细胞中的钙离子浓度的动态平衡。另外，B501处理组样品中显著上调表达的ABC转运器相关基因包括TRINITY_DN18474_c0_g2(P=2.13×10-5)和TRINITY_DN18721_c1_g12(P=0.024)，TRINITY_DN18474_c0_g2编码P-P-键-水解驱动的跨膜转运蛋白，TRINITY_DN18721_c1_g12基因编码离子结合蛋白。ABC 转运器蛋白具有外排泵功能，能与线粒体协作，将ATP水解产生的能量与结合的底物转出质膜[21]，这5个与线粒体和ABC转运蛋白相关的基因上调说明HG-11通过提高能量代谢，促进生物合成，来抵抗B501抗菌物质的伤害(表1)。

2.4.4 HG-11抗氧化胁迫类基因 解淀粉芽胞杆菌能够产生抑菌物质对真菌细胞产生氧化性伤害，导致真菌细胞死亡[22]，而抗氧化作用的酶类则是关注的重点。KEGG 注释的差异表达基因中参与的抗坏血酸和醛酸代谢途径较为显著(rich_factor 为0.41；Q 值为0.006)(图7)。抗氧化酶类相关的上调表达基因有3个，其中TRINITY_DN11958_c0_g1(P=8.39×10-3)基因编码过氧化物酶(Peroxidase，POD)，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)基因编码谷胱甘肽过氧化物酶，TRINITY_DN19192_c2_g2(P=1.07×10-6)基因编码抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。这3个基因可能参与HG-11抗氧化作用，它们的上调表达是HG-11消除自由氧胁迫作用的方式。此外，谷胱甘肽(glutathione, GSH)结合反应在维持细胞氧化-平衡状态、外源物质解毒及抗氧化损伤中起着举足轻重的作用[23]。B501处理组样品中TRINITY_DN11990_c0_g2(P=2.26×10-6)编码S-(羟甲基)谷胱甘肽合酶，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)编码谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)，两基因显著上调表达(表1)。这些与GSH相关的酶类具有抗氧化和解毒作用，HG-11通过上调表达这些基因，消除活性氧和解毒，减轻B501的抗菌物质对HG-11菌丝细胞产生氧胁迫伤害。另外，ABC转运器蛋白主要参与细胞内外物质的转运，其外排泵功能能够将有毒物质排出细胞外，进一步减轻B501的抗菌物质对HG-11菌丝细胞产生氧胁迫伤害。

2.4.5 HG-11细胞凋亡相关基因 已报道的解淀粉芽胞杆菌的表面活性素具有杀菌的作用，表面活性素与细菌生物膜的形成有关[24]，B501能够产生生物膜，一般认为芽孢杆菌在MSgg中可以分泌更多能诱导生物膜形成的表面活性素，表面活性素具有强烈的抑制细菌和真菌的效果，不过产生更多表面活性素的具体机理还不清楚[25]。生物膜细菌对抗生素有很强抗性，具有较强的杀菌能力。HG-11转录组中12个基因与细胞凋亡有关，主要编码细胞凋亡氧化修饰蛋白、细胞凋亡氧化应激蛋白、活性氧因子诱导凋亡等。除TRINITY_DN22470_c0_g1外，其他基因都与细胞凋亡相关，在B501处理组样品中均上调表达。KEGG通路中与细胞复制有关的代谢途径中的4个差异表达基因全部为下调基因(图7)，其中下调基因TRINITY_DN22470_c0_g1(P=0.008)编码DNA连接酶，具有连接和修复DNA的作用，基因下调表达说明细胞修复功能下降。B501处理组样品中TRINITY_DN17049_c0_g2(P=3.19×10-7)基因上调，编码钙离子跨膜转运蛋白，钙离子信号转导对细胞凋亡有重要的调节作用。但该基因的上调表达并未改变HG-11细胞凋亡被抑制的状况(表1)。

表1 尖孢镰刀菌HG-11差异表达基因的GO注释及FPKM值

2.4.6 HG-11对B501胁迫的响应模式 B501对HG-11胁迫影响包括抑制细胞壁和细胞膜的合成，诱导细胞膜渗透性增加，入侵细胞破坏核糖体和线粒体这两个重要的细胞器，并诱导产生活性氧造成细胞氧化伤害，最终导致细胞凋亡。为了应对B501抑菌物质的逆境胁迫，HG-11也运用多种响应手段。本研究综合HG-11各类型基因表达状况，可以看出，HG-11上调葡聚糖合成途径的基因，提高葡聚糖或细胞壁的稳定性；上调麦角固醇合成途径酶，膜靶向共翻译蛋白，应对B501纤维素酶及其他抑菌物质对细胞壁的胁迫。HG-11上调表达脂肪酸合成酶以应对芽胞杆菌抑菌物质对细胞膜的破坏，维持细胞膜的稳定性，减少有害物质的入侵。B501抑菌物质进入细胞后对核糖体和线粒体进行破坏，HG-11上调酰胺合成基因、异柠檬酸脱氢酶以及细胞色素C氧化酶对核糖体和线粒体进行修复，同时抑菌物质在细胞内诱导产生活性氧，对细胞造成伤害，因此HG-11大量表达抗氧化酶类和谷胱甘肽转移酶来消除活性氧，减轻伤害。HG-11细胞凋亡基因的上调表达，DNA连接酶等修复基因下调表达则表明芽胞杆菌抑菌物质能够诱导细胞凋亡。由此可见，HG-11通过调节相应基因的表达以响应B501抑菌物质的胁迫作用。

3 讨 论

本研究利用转录组测序技术分析尖孢镰刀菌HG-11受到解淀粉芽胞杆菌B501胁迫后基因表达特征的变化。结果发现，HG-11通过改变B501的抑菌物质作用位点基因的表达来缓解或减轻胁迫伤害。

细胞壁是生物体防御逆境胁迫的第一道屏障。国外研究发现，引起植物枯萎病的尖孢镰刀菌的细胞壁中总糖蛋白的含量占整个细胞壁重量的50%～60%，并位于细胞壁的最外层，内层由几丁质和葡聚糖组成[26]。因此，病原真菌细胞壁的降解需要多种酶的共同作用。芽胞杆菌抗菌物质包括水解酶类如纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，脂肽类如环脂肽和其他脂肽类，其抗真菌作用机理包括抑制细胞壁合成、抑制细胞膜合成[27]、对细胞膜氧化伤害[28]、破坏核糖体和线粒体等细胞器、促进细胞凋亡等。B501能产生纤维素酶和淀粉酶。芽胞杆菌的纤维素酶抑制纤维素的形成，阻断细胞壁合成，造成细胞壁破裂[29]。芽孢杆菌的淀粉酶能减少病原菌胞外多糖的分泌，降低病原菌的抗氧化活性[30]。而尖孢镰刀菌细胞壁的糖蛋白和核糖体蛋白的抑制可能是由于B501产生蛋白酶的影响。TRINITY_DN67_c0_g1基因上调，该基因参与真菌细胞壁半纤维素木聚糖的生物合成，在缓解细胞壁伤害中能够起一定作用。然而，该基因的上调表达并未改变细胞壁合成被抑制的状况，导致菌丝高度畸形膨大，该现象类似于解淀粉芽胞杆菌MH71抗菌物质对番茄灰霉病菌菌丝的抑制，造成局部膨大或溢缩等[31]。细胞内固醇转运相关的TRINITY_DN17937_c0_g1基因和膜转运相关的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上调表达，可能是HG-11通过促进麦角固醇生物合成以及调整细胞膜的流动性。脂肪酸是形成质膜的重要组成部分，维持细胞膜的流动性。TRINITY_DN18061_c0_g3等5个基因通过参与脂肪酸合成以及脂质的合成和代谢过程来维持细胞膜的渗透性和流动性。但本研究并未发现HG-11菌丝内含物泄漏，可能由于B501发酵液浓度低，产生的抑菌物质少，并未对HG-11细胞膜造成孔洞。

KEGG通路富集分析发现参与核糖体合成途径的基因差异表达最显著，B501处理组样品中共有58个上调表达基因。Iglesias等[32]研究发现，尖孢镰刀菌的抗性基因多位于编码核糖体蛋白的基因上，核糖体能供给细胞蛋白质复合物，可能是HG-11努力维持核糖体的合成，改善蛋白质的产生，以缓解芽胞杆菌抑菌物质对蛋白质的降解作用。线粒体作为细胞内重要的细胞器，HG-11通过上调线粒体基因促进线粒体合成，并上调与三羧酸循环相关的基因促进线粒体产生ATP供给细胞能量。线粒体与ABC转运蛋白协作，将ATP水解产生的能量与结合的底物转出质膜，以缓解芽胞杆菌脂肽类抗菌物质的毒害作用，这与Fravel等[33]的研究结果相似，尖孢镰刀菌体内的ABC转运蛋白与致病性有关，可能在克服生防菌防御反应方面发挥作用。

B501对HG-11的胁迫效应可能造成活性氧自由基积累，从而对HG-11细胞造成伤害。通常，细胞通过抗氧化系统的活化包括过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶活性的提高，以及非酶抗氧化系统中抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)、还原型谷胱甘肽等物质含量的增加来清除氧自由基。B501处理组样品中抗氧化相关基因上调表达，如POD基因、GSTs基因、APX基因和ABC转运器基因等。POD是生物抗氧化防御系统中重要的酶，可以将细胞内超氧阴离子自由基还原为H2O2和氧，减缓和抵御细胞的伤害[34]。GSTs是一大类解毒酶，具有过氧化物酶的活性，在真核生物抗药性和解毒方面起着重要作用[35]。APX是细胞内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，是清除H2O2的主要酶类[36]。真菌的ABC转运器蛋白具有膜外排泵功能，能够将有毒物质排到细胞外，在机体组织防御中起重要作用[37]。因此HG-11中抗氧化胁迫的酶类基因上调表达也会降低细胞内活性氧含量，维持细胞正常的生理活性，从而减少细胞凋亡。

虽然HG-11调节多个途径的多个基因表达来响应B501发酵液中抑菌物质的胁迫，但并未改变HG-11细胞凋亡被抑制的状况。细胞凋亡氧化修饰蛋白、细胞凋亡氧化应激蛋白、活性氧因子等与细胞凋亡相关的基因上调表达，再加上DNA连接酶等修复基因下调表达，导致菌丝高度畸形膨大，最终凋亡。近年来，生防微生物随着可持续农业的发展日益受到重视，但其防效的不稳定性除去生存环境因素，可能与病原菌的抵抗性也有一定的关系[38]。后期应密切关注植物病原真菌对生防微生物的抗性发展，提高对生防菌与病原菌互作机制的认识，找到生防菌防治病原菌的靶标，从而实现精准高效防治。