芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展

■雷新雨 陈玉珂 王桂芹 高永生 于梦楠 张宇柔 王嘉婧 张东鸣，3

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118；3.通化师范学院，吉林通化 134000）

在我国水产养殖业的发展中，抗生素的出现虽然促进了其发展，但也对人和环境造成了严重的危害。因此，农业农村部宣布，从2020年7月1日起，饲料企业将停止生产含有促生长药物饲料添加剂的商业化饲料（中药除外），禁止在饲料中添加促生长药物，这意味着水产养殖业进入了无抗养殖时代。在对抗生素替代品的研究过程中，研究人员发现益生菌是一个好的选择。因此，研究者筛选了多种益生菌，如节杆菌（Conn and Dimmick）、芽孢杆菌（Bacillus）、肠球菌（Enterococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lacto⁃coccus）和微球菌（Micrococcus）等，均可用于提高水产养殖物种的生长和免疫。

益生菌作为安全饲料添加剂用于水产养殖，通过促进宿主生长、提供营养、调节肠道菌群、改善免疫应答、提高饲料利用率、提高消化吸收酶活性、改善水质和提高鱼体抗病力等来增强宿主的健康。在已发现的许多益生菌种类中，芽孢杆菌已被证明具有较好的益生菌特性，这是因为它们能够产生抗菌物质，这些抗菌物质对许多微生物有调节作用，具有非致病性且无毒。与其他益生菌相比，芽孢杆菌在不同的环境中生存具有双重优势（耐热性和较长的保质期）。芽孢杆菌被证明可以增强消化酶活性、抗氧化酶活性、免疫酶活性、免疫相关基因和应激相关基因的表达以及抗病毒活性等，最重要的是维持肠道菌群平衡。芽孢杆菌也提高了鱼对饲料的利用率，从而促进鱼体的生长。因此，文章旨在综述芽孢杆菌种类的形态特征、在调节饲料利用和生长性能、抗氧化、免疫力、抗病力、肠道微生物、相关基因表达及改善水质等方面的研究进展，并对今后芽孢杆菌的研究重点进行了展望。

1 芽孢杆菌种类的特征和形态

芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，是好氧或兼性厌氧菌，这种革兰氏阳性菌是饲养环境中的天然菌群，能够产生和分泌许多细胞外酶，包括蛋白酶（杆菌肽和枯草素）。细胞形态呈杆状，单个、成对或短链状排列，两端为钝圆形；有芽孢，呈椭圆形或柱状，中生或偏中生，孢囊微微膨大；在肉质培养基上形成白色菌落，菌落呈扁平状、边缘不整齐、表面有皱褶；酶分泌的最适温度为37℃。芽孢杆菌对外界环境有较强的抵抗力，对高温、酸性、胆盐和人工胃液有一定的耐受能力。目前用于水产养殖的芽孢杆菌通常是从土壤、养殖水体、鱼的肠道、陆生动物体内和卵圆管绦虫肠道中分离出来的

芽孢杆菌的种类是非常重要的，因为它们有能力产生抗生素或抗生素代谢物，对致病性微生物有颉颃作用。由于具有合成多种具有抗菌活性的代谢物的能力，他们已被应用于医药和制药业，用于控制人、动物和植物的各种疾病。芽孢杆菌还具有抗病毒能力，可以代谢生成杆菌肽、蛋白多肽类、多烯类等活性物质，从而达到抑制有害病菌繁殖的目的，也可以通过与病原菌竞争宿主体内的附着位点，并且协助双歧杆菌等有益菌在宿主体内定植，恢复肠道菌群平衡，并且产生的抗生素和细菌素，能够抑制毒性基因表达和水解酶的产生，如蛋白酶等。应用于鱼类的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短双歧杆菌和淀粉酶芽孢杆菌。

2 芽孢杆菌提高水产动物的饲料利用率和生长性能

益生菌作为一种简单而安全的添加剂，能够提供营养物质，提高消化酶活性，从而提高饲料利用率和消化率来促进鱼体的生长。芽孢杆菌以孢子的形式进入，在肠道上部能迅速地复活并为机体提供有益代谢物质（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种酶类），这些酶类可以将肠道中的大分子分解为小分子物质，促进宿主的吸收。无论是单独或与其他免疫刺激剂联合使用，芽孢杆菌作为益生菌，都能提高水产动物的生长和饲料利用率。芽孢杆菌给药后水产动物的消化酶活性的提高可能是由于细菌自身合成的酶，也可能是芽孢杆菌能够刺激水产动物体内内源酶的产生。有研究发现地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）分泌的植酸酶对商业饲料和豆粕具有良好的消化效率；而且地衣芽孢杆菌在代谢过程中还会产生多种维生素，改善肠道消化功能，进而促进机体对各种营养成分的消化和吸收；地衣芽孢杆菌在生长过程中产生的乙酸、丙酸和丁酸等能降低动物肠道pH，酸化饲料，提高饲料消化吸收率。还有研究发现103CFU/g的芽孢杆菌和鳗弧菌（Vibrio anguillarum）联合使用对白虾（E.ori⁃entis）幼体的生长性能、存活率以及对哈维氏和白斑综合征病毒的抗性都有一定的促进作用，109CFU/g的克劳氏芽孢杆菌（Bacillus Clausii）DE5和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）SE5对石斑鱼（Epinephelinae）的肠道消化酶活性也有改善作用。可见芽孢杆菌在不同水生动物的生长性能方面均有积极作用，但在实际生产中要根据动物种类及生长阶段的不同，制定不同的饲喂方案。

3 芽孢杆菌增强水产动物抗氧化、免疫力和抗病力

吞噬过程和细胞代谢最终会导致活性氧（ROS）的产生，如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（·O2-）和羟基自由基（·OH）。活性氧具有高度的杀微生物作用。这些活性氧引起的损伤被抗氧化酶抵消，因此抗氧化酶保护宿主免受氧化应激。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是鱼类常见的抗氧化酶。已经有研究证实投喂含有107CFU/g芽孢杆菌的饲料后，在第2周和第4周时，水产动物的血清和黏液中SOD和GSH-Px活性均有升高，并且饲料中添加蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳杆菌和地衣芽孢杆菌均能提高草鱼（Ctenopharyngodon idella）的抗氧化能力。上述结果表明，芽孢杆菌可提高动物机体抗氧化能力，从而减少氧化应激带来的相关疾病的发生。

增强宿主免疫力是补充益生菌饮食的重要好处之一。有研究指出，益生菌可以通过调节体液免疫应答和免疫相关基因的表达来调节先天免疫。溶菌酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、蛋白酶和抗蛋白酶、过氧化氢酶（CAT）和髓过氧化物酶（MPO）对微生物感染具有较强的杀菌活性。根据相关研究报道，日粮中添加芽孢杆菌可增强鱼的细胞免疫和体液免疫反应，具体表现为增强抗病性。传染源影响并启动黏液感染的过程是感染至关重要的一步，因为鱼类黏液中有溶菌酶、补体、干扰素、凝集素、免疫球蛋白和卵黄蛋白等免疫物质。但是目前很少有文献表明芽孢杆菌能增强鱼的黏膜免疫。虽然在黏膜免疫中的作用不明确，但芽孢杆菌作为饲料添加剂进入水产动物体内能够促进体液免疫，增强免疫细胞的活性，提高其免疫力的作用是毋庸置疑的。

在水生环境遭受污染的情况下，可能会导致养殖鱼出现肝胆综合征的情况。有研究指出，谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）是用于诊断肝损伤的敏感生物标志物，因为他们本质上是细胞质在细胞损伤后释放到血液循环中。在研究中发现，用添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的饲料饲喂虾，虾体内在养殖过程中也可能会发生细菌感染的疾病。但是，疫苗治疗只对特定的致病菌有效，不能作为通用的控制剂。因此益生菌被作为一种促进鱼类健康和控制疾病的替代品而引入。许多研究也都证明了芽孢杆菌具有改善肝功能的作用，显示出其保护肝脏的潜力，能够减少慢性肝病等肝胆综合征的出现。

益生菌提高鱼类抗病性的机制主要通过产生抗菌物质排除病原体，与病原体竞争营养物质和空间，以及引起宿主非特异性或特异性免疫系统的上调，从而增强对病原体的防御能力。越来越多的研究证明了，芽孢杆菌在细菌疾病防治中有一定的作用。大泷六线鱼（Hexagrammos otakii）体内注射杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）14 d后发现，地衣芽孢杆菌能够延长大泷六线鱼出现死亡的时间，进而降低大泷六线鱼的累积死亡率。经研究发现在日粮中添加芽孢杆菌后，能够增强对海豚链球菌（Streptococcus ini⁃ae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、不动杆菌（Acinetobacter）和杀鲑气单胞菌等的抗性。芽孢杆菌在多种水产动物的养殖中都有所应用，如大泷六线鱼、青虾（Macrobrachium nipponense）和凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）等。以上结果表明，芽孢杆菌能增强水产动物的抗病能力，对于肝胆综合征和细菌性疾病等发生有抑制作用，有利于动物的健康。

4 芽孢杆菌缓解水产动物的胁迫作用

水生动物的应激是由于理化因素发生变化时，水生环境或系统中的任何物理和生理干扰而产生的。在商业养鱼中，应激源是不可避免的，益生菌可以提高鱼的抗应激能力。经研究发现用5 mg/kg浓度的盐刺激黄鲈鱼（Diploprion bifasciatum）后，除热休克蛋白70（HSP70）、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶亚基I在黄鲈鱼肝脏和肌肉中的表达上调外，皮质醇水平也有所上升。凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）在受到各种化学物质和环境胁迫时，饲料中添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的虾抗性较对照组强。这表明，当水产动物出现胁迫情况时可以适当添加芽孢杆菌进行缓解，提高抗应激能力以减少损伤。

5 芽孢杆菌平衡水产动物肠道菌群的作用

肠道菌群对肠道形态、营养物质吸收和代谢机制有重要影响，有益和有害细菌动态平衡的正态分布是保证宿主健康生长的重要基础。研究结果表明，芽孢杆菌能够在水生动物肠道内生长繁殖，形成优势菌群，参与机体的新陈代谢，改善肠道形态，促进动物生长发育。并且有研究表明适当浓度的益生菌可产生抑菌剂，抑制病原菌的生长，与病原菌争夺营养物质，从而提高肠道中益生菌的丰富度。芽孢杆菌对多种水产动物的肠道微生物平衡都有作用，如里海白鱼（Rutilus frisii kutum）、鲶鱼（Silurus asotus）、南美白对虾（Penaeus vannamei）和草鱼等。这说明芽孢杆菌的补充可以帮助水生动物调节肠道微生态平衡，利于畜禽的生长发育。芽孢杆菌与其他制剂的联合使用同样有调节肠道菌群的作用，但其作用机制有待进一步研究。

肠道黏膜屏障与微生物的相互作用对平衡肠道菌群起着非常重要的作用，研究发现，肠黏膜屏障的完整性被破坏，会导致抗原(微生物、毒素)通过黏膜进入肠腔内易位，进而破坏肠黏膜的稳定性。有研究发现草鱼饲料中添加地衣芽孢杆菌可以改善肠道屏障功能，增加绒毛长度，上调ZO-1的表达。这也说明了芽孢杆菌定植在肠道中，不仅能减少有害微生物对肠道屏障的破坏，还可以改善水生动物的肠道形态结构，提高小肠对营养物质的消化率和饲料转化率。

6 芽孢杆菌调控水产动物的基因表达

据报道，芽孢杆菌可增强与炎症、生长代谢、消化过程、细胞骨架、连接复合物蛋白编码基因、抗氧化基因和转运蛋白相关基因的表达。一种混合芽孢杆菌可以通过降低HSP70基因的表达来降低海鲷（Sea bream）幼体细胞应激的严重程度，从而提高鱼对饲养条件的耐受性。如表1所示，芽孢杆菌能够调节异育银鲫（Carassius auratus gibelio）免疫相关基因的表达，如促炎细胞因子（IL-8和IL-1β），还能调节石斑鱼肠道和头部肾脏中的TGF-β1和TLR5的表达，以及尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道中促炎细胞因子的表达。虽然芽孢杆菌能够在基因水平上对水产动物进行调控，但与调节生长和消化酶活性的作用不同，有关芽孢杆菌调控基因表达的研究很少。

表1 芽孢杆菌对水产动物基因表达的影响

7 芽孢杆菌改善水产动物养殖水体的作用

养殖水体环境本身就是一个由多种微生物组成的动态平衡系统，有益菌和有害菌共生。养殖水体的最佳条件和理化状态是水产养殖的一个重要问题，大多数感染可能是由于水质差造成的。许多研究表明，向水体添加有益微生物，使其大量繁殖形成优势种群可抑制有害病菌的生长。在水产养殖过程中，人工饲料、有机肥料和养殖生物的排泄物等会污染水体，在水体中投入地衣芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌增殖后能够产生许多胞外酶，将养殖水体中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机质分解，从而达到减少底泥生成，并且降低养殖水体富营养化的情况。有文献表明，在水中或养殖动物的饲料中添加益生菌可以改善水质，使水适合培养微生物。研究发现饲料中添加地衣芽孢杆菌能显著提高发酵床垫料蛋白酶活性与芽孢杆菌分布数量，在一定程度上提高了粪便原位降解效率。

有研究表明，在虾幼虫中添加不同形式和剂量的益生芽孢杆菌，可显著降低氨和亚硝酸盐水平。许多研究人员报告了芽孢杆菌能通过硝化或反硝化作用使含氮废物矿化，从而降低氨和亚硝酸盐水平，改善了的水质。添加益生芽孢杆菌产生的硝化作用释放氢离子，从而降低pH。处理后记录溶解氧、氨、BOD、TDS、COD、碱度和pH的变化，发现水环境的温度和透明度不受影响。芽孢杆菌在从培养系统中去除有机物方面也很有用。由此表明，芽孢杆菌能够保持水质，使养殖的水产动物更好的生长，对实现可持续发展有重要作用。

8 亟待解决的问题及建议

在实现可持续养殖过程中芽孢杆菌有巨大潜力，他能够增强动物的生长性能、饲料利用率、免疫反应、预防疾病感染尤其是平衡肠道菌群以及改善水质。但是，为了提高益生菌在鱼类养殖中的研究和应用，有一些问题也是亟待解决的：①芽孢杆菌来源于水产动物体内和生活环境的很少；②芽孢杆菌生长繁殖环境在现实中无法达到最适生长条件，所发挥的功能不能达到预期效果；③芽孢杆菌在水产动物生长的各个阶段的最适添加量尚不明确；④芽孢杆菌在保存过程中存在逐渐减少的现象，需要进一步研究；⑤芽孢杆菌进入水产动物体内，与肠道微生物协同作用的机制尚不明确。虽然芽孢杆菌在应用过程中还存在一些问题，但芽孢杆菌制剂具有相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对生产及有害生物综合防治的要求。

针对上述问题提出以下建议：第一，研究清楚芽孢杆菌与水产动物肠道和水体原籍菌群的相互作用机制。第二，进一步优化芽孢杆菌培养、加工和保存的条件。第三，探索不同品种、不同时期、不同规格、不同水体的差异，确定不同的用量，以达到精准养殖。第四，寻找能够与芽孢杆菌进行协同作用的益生菌，制成复合益生菌添加剂，将微生物的作用最大化，这也是以后的发展趋势。