磷脂和酶解磷脂乳化的影响因素研究

闫俊辉， 吴沁雪， 王祥旭， 李维琳，2

（1.华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070；2.农业农村部微生物产品质量监督检验测试中心（武汉），武汉 430070）

磷脂类物质是两性分子，通常被用作乳化剂. 普通磷脂的分子结构中含有两个疏水的脂肪酸酯基团（疏水尾部）和一个亲水的取代基基团（亲水头部）. 酶解磷脂是普通磷脂在磷脂酶的作用下水解后的产物，与普通磷脂相比，其少了一个疏水的脂肪酸酯基团，多了一个亲水的羟基. 研究［1-3］显示，与普通磷脂相比，酶解磷脂的乳化能力、乳化稳定性、抗氧化性、润湿性均有明显提升. 磷脂和酶解磷脂作为乳化剂，其乳化能力受许多因素的影响，如游离脂肪酸、pH、盐离子含量和类型、环境温度等. 已有资料显示，磷脂在储存过程中会自然降解产生游离脂肪酸，采用酶法制备酶解磷脂的过程中也会产生游离脂肪酸，因此磷脂产品中或多或少也会含有游离脂肪酸，但关于游离脂肪酸对磷脂或酶解磷脂乳化能力的影响报道很少. 目前，大多数商业食品都会添加一些矿物质，如钙、钠、镁、钾等多种离子，以满足特定风味和营养的需要，其质量分数一般在0.04%～0.12%之间，其中高钙食品一直是卖点之一，但浓度较高的钙离子添加到液态食品中容易产生沉淀［4］，影响产品品质，而添加磷脂或酶解磷脂可以使这类问题得到极大改善［5］，但是钙离子和钠离子的添加是否会对磷脂和酶解磷脂的乳化能力产生影响还未可知.

乳状液（简称乳液）是一种液体以小液滴形式分散在与之不相混溶的另一种液体中形成的分散体系. 乳液可分水包油（O/W）和油包水（W/O）两种类型. 许多食品、药品和化妆品制剂都属于水包油（O/W）型乳液，且都可以通过添加磷脂类物质来增强乳液的稳定性. 乳液本身是热力学不稳定体系，温度、盐分、pH等因素都可能会对乳液微滴的稳定性产生不同程度的影响. 因此，为了得到更加稳定的乳液，不仅要掌握乳化剂的性能和使用方法，还要了解各种可能会对乳化剂乳化能力和乳液稳定性产生影响的因素.

根据磷脂和酶解磷脂制备过程中可能残留在产品中的物质、使用时常会用到的非磷脂类物质以及环境因素，本研究选取了游离脂肪酸、无机盐、pH和温度这几个因素来分析其对磷脂和不同酶解程度的酶解磷脂乳化能力的影响. 本研究可为磷脂及酶解磷脂的应用提供参考.

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

普通磷脂（大豆磷脂），由郑州四维磷脂技术有限公司生产. C15磷脂（转化率为15%的大豆酶解磷脂）和C60磷脂（转化率为60%的大豆酶解磷脂）均由本实验室自制［6］（转化率越高表明酶解磷脂的酶解程度越高）. 棕榈酸、油酸、磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钠（AR）、氯化钙（AR）、氯化钠（AR）、硼砂（AR）、氢氧化钠（AR）、柠檬酸（AR）均由国药集团化学试剂有限公司生产.

1.2 仪器与设备

pH仪（梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司）、高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）、真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、实验室超纯水系统（四川金澜科技有限公司）、可见光分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）.

1.3 磷脂和酶解磷脂乳液的制备

实验前将所有玻璃器皿浸入体积分数为10%的硝酸溶液中4 h，然后在使用前用去离子水冲洗，以确保玻璃器皿不受污染.

用0.02 mmol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH=7）分别与一定质量的普通磷脂、C15 磷脂、C60 磷脂混合，配制成质量分数为0.15%的磷脂或酶解磷脂溶液. 磷脂或酶解磷脂溶液与大豆色拉油按照10∶3的体积比混合，用机械均质器在10 000 r/min条件下均质3 min，以形成磷脂或酶解磷脂乳液.

1.4 乳化剂乳化能力的测定方法

1.4.1 乳化层法 将配制好的磷脂或酶解磷脂乳液转移到100 mL具塞量筒中，4 h后观察分层情况并记录［7-8］.以未析出油脂的比例（即乳化百分比）表示乳化剂的乳化能力，未析出油脂的比例（即乳化百分比）越大，表示乳化剂的乳化能力越强.

1.4.2 比色法 对文献［9-11］中的乳化剂乳化能力测定方法进行改进，具体如下：首先取200 μL配制好的磷脂或酶解磷脂乳液加入到100 mL容量瓶中，然后加入0.02 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH=7）定容至100 mL，即可得到稀释500倍的磷脂或酶解磷脂乳液；然后通过可见光分光光度计在波长500 nm下测定乳液稀释液的OD值（OD500），以OD500的值表示乳化剂的乳化能力，OD500的值越大，表示乳化剂的乳化能力越强.

1.5 不同影响因素对磷脂和酶解磷脂乳化能力测定

1.5.1 游离脂肪酸 根据大豆磷脂中脂肪酸的种类，选取油酸（OA，单不饱和双键长链脂肪酸，C18∶1）和棕榈酸（PA，饱和脂肪酸，C16∶0）为代表性游离脂肪酸［12-13］，以测定游离脂肪酸对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响. 首先根据本文1.3小节中的方法制备质量分数为0.15%的磷脂和酶解磷脂溶液，然后在磷脂或酶解磷脂溶液中添加不同比例的油酸或棕榈酸，使磷脂或酶解磷脂溶液中油酸或棕榈酸的最终质量分数分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.

1.5.2 无机盐 选取CaCl2和NaCl作为代表性无机盐，通过在磷脂和酶解磷脂乳液中添加不同比例的CaCl2和NaCl来分析无机盐对磷脂和酶解磷脂的乳化能力是否有影响. 称取不同质量的CaCl2添加到质量分数为0.15%磷脂和酶解磷脂溶液中，使磷脂或酶解磷脂溶液中CaCl2的最终质量分数分别为0、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%. 称取不同质量的NaCl添加到质量分数为0.15%磷脂和酶解磷脂溶液中，使磷脂或酶解磷脂溶液中NaCl的最终质量分数分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.

1.5.3 pH 用物质的量浓度为0.02 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH值分别为3、4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、10、11）分别与一定质量的普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂混合，配制成pH值不同的质量分数为0.15%的磷脂或酶解磷脂溶液.

1.5.4 温度 首先根据本文1.3小节中的方法制备磷脂乳液和酶解磷脂乳液，然后将其分别置于量筒中，并于不同温度下（4、25、50、75 ℃）保温4 h，最后根据乳化层法测定磷脂或酶解磷脂的乳化能力.

2 实验结果与分析

2.1 游离脂肪酸对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响

游离脂肪酸对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响见图1.

图1 游离脂肪酸对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响Fig.1 Effects of free fatty acids on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

由图1可知，在磷脂或酶解磷脂乳液中添加不同质量分数的油酸或棕榈酸后均能不同程度地提高磷脂和酶解磷脂的乳化能力；在普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂乳液中分别添加0.4%的油酸后，普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂的乳化能力分别提升了75%、49%、38%；在普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液中分别添加0.4%的棕榈酸后，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂的乳化能力分别提升了79%、53%、48%. 由此可知，棕榈酸对磷脂和酶解磷脂乳化能力的提升效果略好于油酸；不论添加的游离脂肪酸的质量分数是多少，酶解磷脂的乳化能力均优于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越强.

以上结果表明，磷脂产品含有的少量游离脂肪酸对磷脂的乳化能力没有不利的影响. 有研究［14］指出，油酸赋予乳液性能的改善是由于乳液的Zeta电位增加和油酸分子之间的相互作用. 也有研究［15］证明，油酸分子可以被磷脂囊泡吸收，改变磷脂形态，从而使磷脂的乳化能力得以提升. 另有研究［16］表明，在鱼油和水形成的O/W型乳液中添加棕榈酸可以降低O/W型乳液中液滴的表面张力和粒径，因此在乳液中加入棕榈酸可以提高乳液的稳定性.

2.2 无机盐对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响

2.2.1 CaCl2对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响 由图2可知，在磷脂和酶解磷脂乳液中添加少量的CaCl2就会对磷脂和酶解磷脂的乳化能力产生较大的影响，当乳液中CaCl2的质量分数为0.05%时，磷脂和酶解磷脂乳液的破乳效果就已经非常明显. 磷脂和酶解磷脂乳液中CaCl2的质量分数越高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力就越差. 但不论添加的CaCl2的质量分数为多少，酶解磷脂的乳化能力都明显优于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

图2 CaCl2对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响Fig.2 Effects of CaCl2 on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

2.2.2 NaCl对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响 由图3可知，在普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液中分别添加不同质量分数的NaCl 后，普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂的乳化能力均有所降低，但降低幅度很小，说明NaCl对普通磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响均较小. 但不论添加的NaCl的质量分数为多少，酶解磷脂的乳化能力都明显优于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

图3 NaCl对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响Fig.3 Effects of NaCl on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

2.3 pH对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响

由图4 可知，pH 对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响较大，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂的乳化能力均随着乳液pH值的增大而增强，特别是当乳液pH在7～9之间时，磷脂和酶解磷脂的乳化能力提升迅速.另在实验中可观察到，pH对普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液的稳定性也有较大影响，即pH 越低，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液越不稳定，越容易出现相分离，随pH值的增大，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液的稳定性也逐渐增加. 有研究［17］认为，pH对磷脂的化学相互作用以及界面性质都有影响，在较低的pH下，磷脂的表面活性较低，形成的界面膜对聚结的抵抗力也较低，于是乳液液滴趋于聚集，导致乳液的稳定性降低. 也有研究［18］认为，磷脂乳液在较低pH下不稳定可能与磷脂的溶胀性有关，磷脂在较低pH下会成为更易水解的化合物，从而降低了其作为乳化剂的作用，最终导致其乳化能力降低.

图4 pH对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响Fig.4 Effects of pH on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

比较发现，不论在酸性条件下还是在碱性条件下，酶解磷脂的乳化能力均比普通磷脂的乳化能力好，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

2.4 温度对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响

由图5 可知，随着温度的升高，三种磷脂的乳化百分比均不断降低，且普通磷脂的乳化百分比下降的最多，C15磷脂次之，C60磷脂的乳化百分比下降的最少，这表明温度对磷脂和酶解磷脂的乳化能力影响较大，随着温度的升高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力均不断降低. 不论何种温度条件下，酶解磷脂的乳化能力均优于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好. 有研究［19-20］表明，随着温度的升高，非离子乳化剂的亲水头部基团周围会脱水，从而导致其亲水能力以及其在水中的溶解度降低，于是其乳化能力会有所之降低.

图5 温度对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响Fig.5 Effects of temperatures on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

3 结论

通过实验分析了游离脂肪酸、无机盐、pH和温度对磷脂及不同酶解程度的酶解磷脂乳化能力的影响，得出结论如下：

1）磷脂产品中含有的少量游离脂肪酸（磷脂的自然降解产生或制备酶解磷脂时产生，如油酸和棕榈酸）对于磷脂的乳化能力没有不利影响. 相反，外源性游离脂肪酸的添加可以改善磷脂和酶解磷脂的乳化能力.

2）不同的无机盐对磷脂和酶解磷脂乳化能力的影响差别较大. CaCl2的质量分数越高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力越差，但在有CaCl2存在的情况下，酶解磷脂的乳化能力明显优于普通磷脂，且酶解磷脂的乳化能力与酶解程度呈正相关，因此在高钙液态食品中加入酶解程度高的酶解磷脂更有利于产品的稳定. NaCl对磷脂和酶解磷脂的乳化能力的影响较小，因此磷脂类物质适合作为各类咸味食品的乳化剂.

3）在碱性条件下，磷脂和酶解磷脂的乳化能力更好，相应的磷脂和酶解磷脂乳液也更稳定，但是在酸性条件下磷脂和酶解磷脂的乳化能力则大大降低，且酸性越强，其乳化能力越差，乳液的稳定性也越差；无论在碱性、中性或酸性条件下，酶解磷脂的乳化能力都明显优于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

4）高温会使磷脂和酶解磷脂的乳化能力降低，且不利于磷脂和酶解磷脂乳液的稳定，但在高温条件下，酶解磷脂的乳化能力明显优于普通磷脂，且酶解磷脂乳液的稳定性远远优于普通磷脂乳液.