烟草NtCAD基因克隆与表达分析

赵利杰，王 中，罗朝鹏，谢小东，张剑锋，李泽锋，李 锋，杨 军，武明珠

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术开发区枫杨街2号450001

木质素是维管植物细胞壁的主要成分，在植物体内具有增强细胞壁机械强度、运输水分和矿物质以及抵御病虫害等作用［1-3］，根据木质素单体的不同可将木质素分为S型、G型和H型3种类型［4］。肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是合成木质素的关键酶［5］，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的作用下，CAD可催化羟基肉桂醛转化为羟基肉桂醇，即单木酚醇［6］。木质素的组分和含量在CAD基因的调控下会发生变化［7］。拟南芥AtCAD4和AtCAD52个基因同时突变后，木质素含量下降94%［8］；高粱SbCAD突变体植株中，木质素含量下降15%~25%［9］；松树LpCAD自然突变体植株中，松柏醛含量增加，木质素含量下降9%［10］；玉米ZmCAD突变体植株中，G和S型木质素含量下降，木质素含量下降20%［11］；杨树CAD基因通过反义和共抑制法处理后，醛类组分增加，木质素含量不变［12］；苜蓿CAD基因在反义抑制调控下，S型木质素含量下降，木质素含量不变［13］。CAD蛋白结构含有3个保守的结构域，包括Zn离子催化中心［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn离子结合位点［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADP（H）辅酶结合位点［G（X）GGV（L）G］［14-16］。根据CAD核苷酸和蛋白序列的同源性系统发育分析结果，将CAD基因的类型划分为三类［17］。第一类CAD基因主要存在于裸子植物和被子植物中［18］，又被称为bona fideCAD，直接参与木质素的合成，第二类和第三类主要是被子植物的CADs基因，在裸子植物中也存在第三类CADs基因［19］。第二类CADs中不同基因的功能具有差异性，除参与木质素合成，还与植物抗逆性密切相关［20］。第三类CADs基因在木质素合成过程中的作用不大，通常在一些非木质化的组织中可检测到这类酶的活性［21］。

烟草是重要的经济作物，烟叶中木质素含量与其品质密切相关。木质素类物质含量较高的烟叶，其品质相对较差［22］，主要原因是木质素在燃烧时产生刺激性气味，掩盖烟叶的香气［23-24］。此外，在热分解时木质素会产生一种能引起涩口感觉并有致癌作用的物质儿茶酚［22,25］。目前关于烟草CAD基因的研究相对较少，本研究中以普通烟草K326的cDNA为模板克隆得到1个NtCAD基因，对其进行生物信息学分析和烟草不同组织的表达模式分析，并分析低温（4℃）胁迫和脱落酸（Abscisic acid，ABA）处理后该基因的表达情况，旨在揭示NtCAD基因功能，为烟叶品质的提升提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 烟草材料

K326种子用15% NaClO消毒15 min后，用灭菌水反复冲洗5次，播种于无菌的二分之一MS培养基中。幼苗长出4片真叶时，移栽到二分之一MS（无琼脂）中进行培养，待幼苗长出6片真叶后，选取长势均匀的幼苗进行低温（4℃）和10 μmol/L脱落酸（ABA）处理，在0、3、6、12、24 h处理后取样，每处理取3株幼苗，经液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存备用。

田间试验在湖南郴州桂阳县烟草基地进行，供试品种为K326。烟苗长至5片真叶时于清明节前后移栽，选取长势一致的6株烟草，在盛花期采集幼叶叶片、成熟叶叶片、侧根、须根、茎节、茎秆、花蕾及花组织，每个组织采集6份，用于分析NtCAD基因在烟草不同组织中的表达情况。

1.2 烟草总RNA提取和cDNA合成

烟草总RNA用GenePure Plus多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒（北京密码子生物科技有限公司）提取。用超微量核酸蛋白测定仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］测定RNA的浓度和完整性，RNA反转录具体步骤参照PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］的说明书。

1.3 烟草NtCAD基因全长克隆

从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载并得到的拟南芥的CAD基因序列，在烟草基因组数据库（www.tobaccodb.org）中进行Blast比对。利用Primer Premier 6对相似性最高的基因序列设计PCR扩增引物（上游引物：5'-TTTCTGCTCTAAAAC AATCGT-3'，下游引物：5'-AGCCTTGTATAATAGTG AACC-3'）。以烟草幼苗的cDNA为模板进行扩增，PCR反应总体系20 µL（cDNA 2 μL、Taq PCR Starmix 10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 6 μL）。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min。

使用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增得到的PCR产物，用DNA纯化试剂盒（北京全式金生物有限公司）对目的片段进行回收，回收得到的产物连接pMD19-T simple vector［宝生物工程（大连）有限公司］并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞（北京擎科生物科技有限公司），经验证阳性后，将菌液送至华大生物技术有限公司测序。

1.4 烟草NtCAD蛋白生物信息学分析

ORF（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析烟草NtCAD的基因序列，ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分 析NtCAD蛋 白 的 蛋 白序列，PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测启动子区顺式作用元件，SMART软 件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtCAD蛋白的结构域，Protscale软件（https://web.expasy.org/protscale/）分析NtCAD蛋白的亲水性及疏水性，PSORT软件（https://www.genscript.com/psort.html）分析NtCAD蛋白的亚细胞定位，PSIPRED软 件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测NtCAD蛋白的二级结构，SWISS-MODEL软件（http：//swissmodel.expasy.org/）预测NtCAD蛋白的三级结构，使用NCBI Blast在线工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行CAD核酸和氨基酸序列的同源性比对并下载相关序列，使用MEGA 7.0软件采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树，使用DNAMAN软件对CAD氨基酸序列进行比对分析。

1.5 烟草NtCAD基因表达分析

以烟草盛花期不同组织和不同条件处理下的cDNA为模板，用qPCR方法分析NtCAD基因的相对表达量。根据NtCAD基因序列设计荧光定量PCR引物（上游：5'-TCTGATGGCAAACCTACCCA A-3'，下游：5'-TTCAATGGGCTGTACACTGTC-3'）。反应总体系20 μL（cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10 μL qPCR SuperMix，6 μL ddH2O）。反应程序：94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火20 s，45个循环。每个实验做3次生物学重复，相对表达量用2-△△CT公式计算［26］。分别以成熟叶叶片和不同处理0 h为对照（表达量设为1），该基因在不同组织或不同处理时间的表达量与对照组的比值为该基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 烟草NtCAD基因克隆

以烟草幼苗cDNA为模板，经PCR扩增，切胶回收，验证克隆后得到1条单一条带，长度约为1 200 bp左右的，与预期的PCR产物长度一致（图1）。测序得到一条全长为1 074 bp的CDS序列，编码357个氨基酸。

图1 NtCAD基因的PCR电泳图Fig.1 PCR electrophoretogram of NtCAD gene

2.2 烟草NtCAD蛋白生物信息学分析

利用NCBI Blastp对克隆得到基因的氨基酸序列进行同源比对，结果显示其与牵牛花（Ipomoea nil）、咖啡（Coffea arabica）的CAD氨基酸序列相似性分别为86.80%和84.31%，所以将其命名为NtCAD。

利用MEGA 7.0用邻接法构建NtCAD和其他物种的CAD氨基酸序列系统发育树（图2）。结果显示：NtCAD与辣椒（Capsicum annuum）CaCAD、三 裂 叶 薯（Ipomoea triloba）ItCAD和 牵 牛 花（Ipomoea nil）InCAD的亲缘关系最为接近。进化树显示NtCAD属于GroupⅠ（第一类），该类基因直接参与并促进木质素的合成。

图2 植物CAD同源蛋白的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of plant CAD homologous proteins

用SMART在线软件对NtCAD进行蛋白保守结构域检测，显示NtCAD具有一个完整的醇脱氢酶结构域和一个辅酶分子结构域。用DNAMAN对烟草NtCAD和其他物种CADs氨基酸序列进行多重比对，结果显示：不同物种CAD氨基酸序列均存在Zn离子催化位点［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn离子结合位点［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADPH辅酶结合位点即［G（X）GGV（L）］保守的功能结构域（图3）。说明CAD在不同的物种中，其底物结合位点均具有保守性。

图3 不同植物CAD蛋白序列的比对Fig.3 Alignment of CAD protein sequences in different plants

分析发现NtCAD预测蛋白分子量为38.99 kDa，等电点为5.54，共有44个氨基酸残基（Asp+Glu）带负电荷、35个氨基酸残基（Arg+Lys）带正电荷。预测蛋白的不稳定系数为26.87%，表明NtCAD蛋白为稳定性蛋白。其亲水最大值为-2.800，疏水最大值为2.433，表明该蛋白为亲水性蛋白。预测分析发现该蛋白位于细胞质中。

NtCAD蛋白的二级结构预测结果显示，其主要由23.81%的α-螺旋、43.14%的不规则卷曲、8.12%的β-转角和24.93%的延伸链构成（图4）。NtCAD和AtCAD5的氨基酸序列相似性78.65%，以拟南芥AtCAD5蛋白为模板，用SWISS-MODEL对NtCAD蛋白的三级结构进行建模，得到该蛋白的三级结构图（图5）。在拟南芥木质素的合成过程中AtCAD4和AtCAD5起关键作用［8］，推测NtCAD也具备和AtCAD5相似的功能。

图4 NtCAD蛋白二级结构预测Fig.4 Secondary structure prediction on NtCAD protein

图5 NtCAD蛋白三级结构预测Fig.5 Tertiary structure prediction on NtCAD protein

2.3 烟草NtCAD基因表达分析

用实时荧光定量PCR分析烟草盛花期NtCAD基因在不同组织中的表达情况，发现盛花期不同组织中NtCAD基因均有表达，花蕾、侧根和须根中NtCAD的表达量较高，叶片（成熟叶）和茎（茎秆、茎节）中的表达量相对较低（图6）。

图6 NtCAD基因在烟草盛花期不同组织中的表达Fig.6 Expression of NtCAD gene in different tissues at full-bloom stage of tobacco

通过分析烟草NtCAD基因启动子序列，发现NtCAD启动子区域含有参与低温（LTR）和脱落酸（ABA）应答的顺式作用元件。低温（4℃）处理3 h，NtCAD基因的表达量显著升高，处理12 hNtCAD基因的表达量最高，和对照比上升了5.04倍（图7A）。激素ABA处理后，NtCAD基因的表达量呈周期性变化趋势，3 h表达量较对照值显著升高，6 h和12 h有所下降，24 h表达量显著升高，和对照比上升了1.97倍（图7B）。

图7 NtCAD基因在不同处理下的表达Fig.7 Expression of NtCAD gene under different treatments

3 讨论

从烟草中克隆得到的NtCAD基因CDS长1 074 bp，共编码357个氨基酸。NtCAD氨基酸序列具有CAD基因保守的结构域，其蛋白三维结构和底物结合位点也具有高度保守性［17］。NtCAD与拟南芥AtCAD4、AtCAD5在进化上属于同一分支，亲缘关系较近，均属于GroupⅠ类基因［14］，该类CAD基因能够直接调控木质素的合成［18］。

NtCAD基因在烟草盛花期各个组织中都有表达，但在花蕾和根中的表达量相对较高，在茎和叶片的表达量相对较低。此外，在其他植物中也发现CAD基因存在组织特异性表达的情况，例如拟南芥AtCAD4基因在根中的表达量较高，茎中的表达量相对较低，AtCAD5在木质化程度较高的拟南芥根部具有较高的表达量［20,27］；高粱SbCAD在茎中的表达量较高，叶片中几乎不表达［28］；马尾松CAD基因在侧枝中表达量最高，根，叶和芽的表达量较低［29］；胡萝卜DcCAD基因在叶片中的表达量显著高于叶柄和根［30］，推测与这与CAD基因的功能多样性有关。

对烟草NtCAD基因启动子序列进行分析，发现其有响应低温和ABA处理的顺式作用元件。

对烟草幼苗进行低温和ABA处理，两种处理均能上调NtCAD基因的表达，说明NtCAD基因可以响应非生物胁迫。丹参SmCAD的表达可以被茉莉酸甲酯（MeJA）诱导［31］；胡萝卜DcCAD基因在低温（4℃）处理2 h后，表达量显著升高［30］；甘薯IbCAD1的表达可被ABA、水杨酸（SA）和MeJA诱导［32］。推测不同的CAD基因，对非生物胁迫的响应不同。

4 结论

从烟草K326中采用基因克隆方法得到NtCAD基因，系统发育以及蛋白结构分析结果显示其属于CAD基因GroupⅠ。NtCAD基因的表达具有特异性，在烟草盛花期的花蕾和根中的表达量较高。低温和ABA处理能够诱导NtCAD的表达，说明该基因还参与烟草非生物胁迫的应答过程。