异鼠李素对神经胶质瘤细胞C6的抑制作用及机制研究

摘要：目的 探究小分子化合物异鼠李素对神经胶质瘤的抑制作用。方法 选择神经胶质瘤细胞C6细胞株为实验模型，通过噻唑蓝（MTT）比色法实验检测0、1、5、10、25、50μM的异鼠李素对C6细胞增殖的抑制作用，利用平板克隆实验验证异鼠李素可以抑制C6细胞的克隆形成能力，并通过免疫蛋白印迹（Western blot）法检测不同浓度的异鼠李素对细胞蛋白表达水平影响。结果 异鼠李素明显抑制C6细胞的增殖、克隆形成能力。并且，异鼠李素能够下调CDK2的蛋白表达。结论 異鼠李素可能靶向CDK2，并通过下调CDK2的表达从而抑制C6细胞的生长。

关键词：大鼠;神经胶质瘤;异鼠李素;C6;CDK2

肿瘤是在许多致癌因素的作用下，引起局部组织增生而形成的赘生物，并可以通过血液、淋巴液进行远处转移至全身不同脏器，是目前威胁人类健康最重要的疾病之一。据统计世界上每年都有超过 1400 万的人患上肿瘤[1]，并在 2015 年之后肿瘤在全球死亡病因中列居第二[2]。饮食、慢性炎症、吸烟、辐射、大气环境污染等都可以促进肿瘤的发生。

在恶性肿瘤中，神经胶质瘤是一种中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的50%。神经胶质瘤好发于成人，肿瘤细胞呈弥漫性生长，肿瘤边界不清、恶性程度高等特点导致神经胶质瘤患者五年生存率低于10%，严重危害人类健康[3]。

1 方法

1.1 MTT法检测异鼠李素对C6细胞增殖的抑制作用

收集细胞并合理调整细胞浓度，5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加不同浓度梯度的异鼠李素后每孔加入20 μL MTT溶液。4h后终止培养，每孔加入150 μL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。后将数据整理利用Graphpad prism软件进行作图分析。

1.2 平板克隆实验检验异鼠李素对C6细胞克隆形成的抑制作用

每孔2000个对数生长期的C6细胞接种于六孔板中，隔天给药后置于CO2培养箱中培养7天左右。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，用PBS清洗细胞2次。加4%多聚甲醛固定液5 mL固定细胞15分钟。然后去固定液，加适量结晶紫染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。用肉眼直接计数克隆，最后计算克隆形成率，Image J软件计数并作图分析，克隆形成率（对照组）=实验组克隆数/对照组克隆数*100%，后将数据整理利用Graphpad prism软件进行作图分析。

1.3 Western blot检测异鼠李素作用后CDK2的表达水平

异鼠李素处理C6细胞后，对细胞裂解提取总蛋白。方法为，去除培养基，用PBS涮洗，每皿加入50 μL细胞裂解液，并使培养皿倾斜放入冰中10 min使细胞裂解充分，将细胞裂解液转移至灭菌1.5 mL EP管中，使用冷冻高速离心机在4 °C的条件下进行离心后将沉淀弃掉，上清液即为细胞总蛋白。随之利用BCA法测蛋白浓度。一抗4 °C过夜，二抗常温孵育1 h，自动发光凝胶成像系统读取结果，分析结果。

1.4 统计学分析

本研究采用Graphpad prism软件进行数据处理并绘图，P<0.05可说明结果具有统计学差异。

2 结果

与对照组相比（图1），异鼠李素能够明显抑制C6神经胶质瘤细胞的增殖能力。并且，随着异鼠李素浓度的升高，C6细胞的增殖活力明显下降，在浓度为25 μM时，细胞存活率仅为45%。当浓度达到最大给药浓度50 μM时，细胞存活率下降了65%左右，这说明异鼠李素对C6肿瘤细胞具有明显的杀伤效果。

细胞伤口愈合实验所示（图2、3），和对照组相比，在相同给药时间下，C6细胞的迁移能力随着药物浓度的增高呈下降趋势。异鼠李素可以有效抑制C6神经胶质瘤细胞的迁移、克隆形成能力。

实验发现CDK2蛋白随着异鼠李素浓度的增高而下降（图4）。对western blot条带结果所进行灰度值统计分析发现（图5），药物浓度为10 μM时，CDK2的蛋白已下降50%以上。因此，异鼠李素可下调C6细胞CDK2蛋白的表达。

3 讨论

C6是一株来源于大鼠的神经胶质瘤细胞。CDK2蛋白的异常高表达与肿瘤细胞的发生发展密切相关，尤其该蛋白在细胞周期信号通路中发挥着举足轻重的作用。本文研究显示，异鼠李素能够显著降低CDK2蛋白表达水平，并且对C6神经胶质瘤细胞的增殖、迁移有抑制作用，因此可推测，异鼠李素可能通过降低CDK2蛋白的表达，影响了肿瘤细胞细胞周期通过，最终抑制神经胶质瘤生长。然而这些具体作用机制需要进一步深入研究。

相信通过科研的不断深入，进一步了解小分子药物异鼠李素的抗癌机制，相信在不久将来对神经胶质瘤分子靶向治疗领域将会有一个质的飞跃，造福全人类。

参考文献：

[1]RUSSO M，RUSSO G L，DAGLIA M，et al.Understanding genistein in cancer：the“good”and the“bad”effects：a review[J].Food Chemistry，2016，196：589-600.

[2]WE Library.National bureau of statistics of China.China statistical yearbook[M].Beijing：China Statistics Press，2010.

[3]AQUILANTI E，MILLER J，SANTAGATA S，et al.Updates in prognostic markers for gliomas[J].Neuro-oncology，2018，20：17-26.

作者简介：马徐民，1993年10月生，男，汉族，湖北襄阳，助教，硕士研究生，小分子化合物抗肿瘤细胞的机制研究。