新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响

段学明

摘要：目的：针对在展开新型冠状病毒核酸检测时，样本的混采对最终检测结果造成的影响进行讨论。方法：研究开展时间为2020年5月，将进行采集不超过24小时的核酸阴性拭子作为本次研究目标，采集样本数量为10支。将10支拭子全部置于6ml病毒保存溶液中，进行充分混匀。混匀后以1∶2以及1∶10的比例稀释。分别加入经灭活操作的2019新冠病毒培养液中，来模拟10混1、5混1和单独检测。利用a试剂以及A-E 5种模板上样量和检测灵敏度均有差异的扩增试剂进行分别提取和扩增。结果：在模拟环境下，相同的混采样本中，a提取模板中的单独拭子检测数据有明显超前趋势;在相同混采核酸模板中，A试剂的N基因检测循环阈值相较于B试剂更提前。扩增体系中加入的10拭子核酸造成A试剂检测阈值之后，B试剂则无任何影响。a试剂提取10混1的混采样本后，C、D、E试剂扩增的检测循环阈值相较于单独检测样本更高。结论：混采过程中大量人基因组DNA會对提取和扩增效果进行干扰。在扩增样本采集体积增强提取试剂时，在扩增试剂选择上也要做出改善，选择模板量上样大的扩增剂可以在进行核酸检测时提高灵敏性，避免漏检。

关键词：新型冠状病毒;核酸采样;核酸检测

【中图分类号】Q946.2             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）11--01

2019新型冠状病毒肺炎始发于2019年12月的传染性肺炎。其具有极强的传染性，同时引起该病的病原体从未在人类流行病学中发现的新型冠状病毒。据数据调查显示，目前在大多数人群中该病毒的潜伏周期时长为1-14天，所以要对外出人员进行核酸检测以及隔离措施，以便判断其是否为新型冠状病毒携带者。在进行核酸检测过程中逐渐出现核酸检测量大导致的检测准确性以及检测效率逐渐下降的现象。对此，我国针对这一现象出台了新冠病毒核酸10混1混采技术规范，并在我国多地进行实施。本篇因研究对混采对核酸检测结果造成的影响进行了评估，详细内容如下。

1资料与方法

1.1基础资料

研究所使用的材料为灭活病毒培养液（经65°持续热灭活30min以上）、a核酸提取试剂以及A、B、C、D、E五种新冠病毒核酸检测试剂。研究所使用仪器为数字PCR仪器、核酸提取仪器、扩增仪以及荧光定量PCR仪。

1.2方法

①对灭活病毒培养液进行定量检测。②使用a提取5000拷贝数/ml的模拟混采样本，利用A与B扩增提取产物。③对混采造成提取上的影响进行验证：取6ml病毒保存液加入采集管中，将10支阴性咽拭子放入统一采集管中充分混匀，得到10混1样本。再用VTM以1∶2和1∶10的比例将样本进行稀释，得到5混1样本和单独拭子样本。将灭活病毒培养液进行稀释后分别加至三份样本中。使用a提取试剂进行样本提取。同时利用A、B两种核酸检测试剂扩增提取产物。将不同时机提取的效率和混采对提取的影响进行数据比对。④对混采造成扩增上的影响进行验证：将6mlVTM加入采集管中，将10支阴性拭子放入统一采集管并进行混匀。将灭活病毒培养液进行稀释。利用a核酸提取试剂盒分别提取阴性拭子核酸以及病毒核酸，洗脱至1/2体积，得到拭子模板和病毒模板混合体。利用A、B两种检测试剂盒进行扩增。

1.3判定指标

比对在使用a试剂进行提取时，单独拭子、10混1拭子以及5混1拭子的样的循环检测数据。

1.4统计学分析

试验各指标均通过统计学软件SPSS25.0检验，卡方比对计量资料（%）率;t值比对计数资料（均数±标准差）;如组间数据有差异（p<0.05）。

2结果

2.1将A、B试剂扩增模拟混采样本循环检测阈值进行数据比对

a试剂提取时，单独拭子的检测值相较于5混1余10混1比例来说明显降低，数据组间呈现较明显差距（P<0.05）。详见表1。

3讨论

新型冠状病毒爆发相较既往出现过的疫情存在着潜伏期较长，且同时具有个体差异的特点。并且在传播过程中通过不断更换宿主，其结构可通过自身变化发生变异。故在防治过程中就出现了较大困难。根据传染病学的防治原则，在传播的阻断过程中以“防大于治”为基础方针。针对与患有新型冠状病毒肺炎进行过密切接触或与其进行过间接接触的人员，对其进行隔离措施。但通过隔离无法立即得出其是否出现感染、是否为潜在携带者等结论。因此针对该问题，我国立即展开相应措施。新型冠状病毒在对人体进行感染后，会先在其呼吸道中进行增殖，因此刻通过对人体呼吸道中的分泌物进行核酸检测即可得出该患者是否为病毒携带者的结论。

在生物学角度中，所有碳基生物都有核酸这一物质，是构成其生命组成的必要部分。在新型冠状病毒引起的肺炎暴发后我国科学家立即对其核酸序列进行了解码，并了解到其结构上存在的特异性。新型冠状病毒检测本质是对病毒的RNA（核糖核酸）进行检测的过程。除了通过检查患者呼吸道分泌物这一途径检验其是否为携带者以外，还可通过对其分辨、血液等标本进行检验。在进行新型冠状病毒的核酸序列检测时，通常应用荧光定量法进行检验，即聚合酶链式反应。检验过程中应用的PCR反应模板仅为单一脱氧核糖核酸（DNA）。因此应在进行反应前对新型冠状病毒的核酸进行逆转录，使其与模板相同。在PCR反应体系中，存在着特意吸引物与相应探针。探针本质为特异性寡核苷酸序列中的一段，其两端分别标记了荧光报告基团以及淬灭荧光基团。在探针结构完好时，探针两端上的基团会出现淬灭基团吸收报告基团的现象。当新型冠状病毒反应体系存在靶序列时，反应探针与模板产生结合，DNA聚合酶会沿着末班对探针酶进行降解，探针两端的基团分离，此时就会出现荧光效应。当DNA链进行扩增时荧光量也会随之增加。因此的出结论，荧光定量法中，PCR检测出的荧光达到的Ct数值与新型冠状病毒的分子浓度存在负相管关系，即新冠状病毒核酸的生物分子浓度越大，Ct值越小。在针对新型冠状病毒进行检验的过程中，存在假阴性及假阳性的现象。这与病毒的增殖量、增殖速度、检测试剂下限、试剂对病毒的检测能力，敏感程度、采样过程是否操作标准并符合规定等因素有密切联系。

在进行核酸检测时，采集样本试剂、以及检测材料都对检测结果起到决定性作用。进行单人份核酸检测时，可通过内标基因检测阈值来判断检测质量。10混1采样时，仅可以通过检测阈值来进行判断，无法对每一份样本都进行检测，因此更容易因采集样本原因出现漏检现象。

综上所述，在进行核酸检测时，其结果受到检测试剂、检测样本等因素影响。试剂提取性更是混采时准确性的关键。在进行混采时，加样量增大、提取效率高的提取试剂配合检测灵敏度高的扩增试剂，可以在检测时保证样本检出的准确性，极大程度降低漏检几率。漏检率的降低在一定程度上对新型冠状病毒的防治起到了意义，在避免出现阳性病例未检出的情况的同时，一定程度上避免了潜在携带者由于通勤等原因造成的疫情暴发最终导致疫情难以控制等现象，间接减少了我国对疫情防控的压力。在地方实验室条件允许的情况下可以进行继续应用。

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