水稻稻瘟病抗性基因及稻瘟病菌无毒基因研究进展

张丽丽，桑海旭，马晓慧，毛 艇，阙补超，王绍林，张 战，于深州，李春泉

（辽宁省盐碱地利用研究所，辽宁 盘锦 124010）

水稻（Oryza sativa L.）是世界重要的粮食作物之一，也是我国重要口粮作物，水稻生产在确保我国粮食安全上具有重要地位，2017 年以来，我国每年水稻种植总面积达3 020 万hm2，产量达2亿t 以上[1-3]。 稻瘟病是由子囊菌引发的水稻真菌病害，是水稻生产上最为重要的病害之一，每年可引起大幅度减产，严重时甚至颗粒无收，对水稻产量和品质都造成严重影响[4-5]。 研究发现，近20 年稻瘟病病害呈现不断上升趋势[6]。 近年来，我国水稻稻瘟病年平均危害面积在7 500 万hm2左右，每年因此损失的水稻产量高达数亿公斤[7]。目前水稻生产中主要通过种植抗性品种和化学防治来降低稻瘟病的危害，但是化学防治方法费用较高，且易对环境造成污染[8]。随着水稻和稻瘟病病菌的基因测序工作的基本完成， 结合水稻与稻瘟病菌互作的基因对基因假说，关于稻瘟病抗性基因、稻瘟病菌无毒基因的研究取得显著进展， 为水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种、 基因工程育种及稻瘟病绿色防治提供了广阔的前景。

1 水稻稻瘟病菌侵染机制

随着分子技术快速发展， 国内外学者对稻瘟病的侵染过程有了更深入了解， 其侵染路径逐步清晰明了，尤其在分子水平上有关酶及蛋白的响应、 植物激素防御反应信号传导途径等方面，取得了大量研究成果[9-11]。 侵染过程主要分为两个阶段。

第一阶段是在细胞外形成附着胞[12]。 分生孢子是由三个隔间细胞组成的结构。 当分生孢子附着在寄主表皮细胞上以后， 尖端的芽孢及它分泌的粘胶就会粘在植物细胞表面， 接着分生孢子利用本身细胞内的营养物质在其顶端的细胞萌发形成极化的发芽管，这一步叫做“挂钩”，是病菌对可侵染植株的识别阶段[13]。 发芽管继而特异性分化产生有黑色素的附着胞， 黑色素是很大一部分致病菌毒性的特征， 这些黑色素可以减少紫外线对病菌的伤害，或者作为一种毒性代谢物[14]。 同时发现只有在植物细胞疏水性的表面才可以产生附着胞， 且需要MAP 激酶、cAMP 应答途径以及植物几丁质的参与[15]，同时会发生分生孢子的自我吞噬现象，且容易受外界温度的影响。

第二阶段主要是涉及菌丝在植物细胞内的形态发生。当附着胞形成后，本身会由于甘油的累计而膨胀，最终会在附着胞的底部产生一个“侵入钉”，这个“侵入钉”内部含有大量的微丝、微管，利用物理压力穿透寄主组织的角质层和表皮细胞壁[16]。“侵入钉”侵入细胞内后，首先在非原生质体上分化为管状的初始菌丝，最终形成胞内侵入菌丝，这时的水稻细胞仍未被杀死，这种状态叫做活体营养[17]。 菌丝通过胞间连丝向周围的健康细胞扩散，直到水稻细胞死亡。当病菌在水稻细胞内大量繁殖时，它能调节营养供应体系，使自身的繁殖不受制约， 同时产生大量有毒物质毒害细胞。5～7 d 后， 就有大量的分生孢子涌出并作为新的感染源感染周围的植株。

2 水稻稻瘟病抗性基因定位与克隆

2.1 稻瘟病抗性基因定位

20 世纪60 年代，日本学者最先开展了稻瘟病抗性基因的研究， 并通过经典遗传分析法鉴定出了多个稻瘟病抗性基因。随后，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了相关研究， 大量的抗病基因不断被鉴定。 国内外学者利用不同群体定位了多个抗稻瘟病基因， 例如Yu 等、Hayashi 等、Liu 等、Wang 等、Pan 等、Berruyer 等、Chen 等[18-24]。研究统计发现被定位的抗性基因来源于不同的野生稻资源和品种[25]。 目前定位的抗性基因分布在11 条染色体上（3 号染色体除外），大部分集中在第6、11 和12 这3 条染色体上，在第11 染色体定位了Pi2、Pil、Pil8、Pi7、Pi44、Pik 等多个基因。 在12 号染 色体 上存 在1 个 由Pi4、Pi6、Pi20、Pi21、Pi31、Pi32、Pitq6、Pita 和Pita2 等多抗性基因组成的抗病基因簇，具有显著的广谱抗性[26-27]。 广谱抗性基因Pi9 被定位在第6 条染色体短臂上， 它首次是从小粒野生稻导入栽培稻中被发现， 并对不同国家的43 个稻瘟病菌表现出高抗[28-29]。 Pi40 也是具有广谱抗性的基因， 它对来自韩国和菲律宾的多个菌株表现出较高抗性[30]。 此外，Huang 等[31]利用抗性品种将Pi47 定位在第11 染色体，Deng等[32]定位了广谱抗性的Pigm，对来自中国的9 个生理小种表现出明显抗瘟性。

2.2 稻瘟病抗性基因克隆

截止到目前， 鉴定的抗稻瘟病基因已超过100 个，已克隆的36 个[33]，被分为四类：①NBSLRR 类蛋白， 例 如Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pi25、Pi35、Pi36、Pi37、Pi40、Pi56、Pi64、Pi-ta、Pib、Piz-t、Pikm、Pit、Pid3、Pish、Pik、Pik -p、Pia、Pigm、Pb1、Pi -CO39、Pi63、Pid3-A4、Pi54rh、Pi54of 和Pike 等29个抗性基因[27]。②RLK 类蛋白，例如Pid2，它位于第6 号染色体，且有多个等位基因，克隆自水稻品种地谷，属于组成型表达的单拷贝显性基因。Pid2通过单个氨基酸差异区别抗感基因[34]。③富含脯氨酸结构域蛋白，例如Pi21。 Pi21 是一个隐性基因[35]，其编码蛋白结构域共有5 个富含脯氨酸的区域，它的抗性来源于蛋白功能的失活[36]。 ④富含ARM 重复序列蛋白，例如Ptr。 Ptr 编码一个非典型的广谱抗性蛋白, 包含4 个Armadillo 重复区，Ptr 的抗性与Pita 和Pita2 有关， 研究还发现，该基因是单子叶植物所特有的[37]。 ⑤TPRs 类蛋白，例如Bsr-k1，该基因具有对稻瘟病和白叶枯病双重抗性，主要原因是Bsr-k1 功能丧失，同时它还是一个具有广谱抗性的隐性基因[38]。

3 稻瘟病菌无毒基因

水稻与稻瘟病菌之间的特异互作关系符合经典的基因对基因学说[39]。 无毒基因（AVR）是一类能够诱发植物产生抗病性的病原物遗传因子，在稻瘟菌与水稻互作中， 无毒基因的作用是转录翻译成无毒蛋白质，然后被水稻细胞内的R 基因识别进而产生抗性[40]。 目前已鉴定且与抗性基因相对应的无毒基因共24 个，12 个基因被克隆。 例如Avr-Pita、ACE1、Avr-Pizt、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL1、PWL2、Avr-Pi9 等，其中只有前两种基因不参与编码分泌蛋白[41-42]。 目前，Pi-ta、Piz-t、Pik、Pia、Pi-CO39、Pi54、Pii、Pi9 和Pib 等抗性基因相对应的无毒基因已被克隆， 而且绝大多数抗性—无毒蛋白分子互作关系已明晰， 分直接互作和间接互作两类。 其中直接互作包括：①抗病蛋白和无毒蛋白的一一对应。 例如Pi-ta 与AVR-Pita 和Pi54 与AVR-Pi54， 其中Pi-ta 与AVR-Pita 间的互作跟抗性蛋白Pi-ta 的LRR 结构域变化有关，二者均为直接互作，差异在于Pita 的防御应答条件[42-43]。 ②两种抗性蛋白对应一个无毒基因。 例如Pik，研究表明Pik 由两个蛋白组成（Pik-1 和Pik-2），Pik-1 可跟AVR-Pik 直接互作， 但Pik-2 不能独自作为AVR-Pik 的受体，必须以复合体的形式才能参与防御反应[44]。 值得关注的是， 抗病基因Pik 和无毒基因的AVR-Pik各自都有不同数量的等位基因， 而且不同抗病基因和无毒基因间可相互识别， 表明抗性基因和无毒基因间等位基因的相伴存在， 阐明抗病基因与无毒基因之间的协同进化机制。③成对的抗病蛋白跟多个无毒基因互作。例如Pia，Pia 的两个成员RGA4 和RGA5， 二者在参与调控防御反应时，只有RGA5-A 与AVR-Pia 或AVR1-CO39 互作，且RGA5 中RATX1 域在与无毒基因作用时发挥重要作用[45]。

4 展望

目前，随着分子生物学的快速发展，水稻抗性基因鉴定、 克隆及水稻—稻瘟病互作机制的研究取得了显著进展。截止目前，鉴定和克隆了大量的抗性基因和无毒基因， 并对二者间的互作机制进行了深入解析， 这些基因为抗稻瘟病育种提供了新思路和新材料。 很多研究者把已知抗性基因运用到抗稻瘟病育种实践中， 并获得了一批具有广谱抗性又高产的水稻新材料， 已在农业生产中被广泛利用[46-48]。 由于水稻与稻瘟病菌之间存在着极其复杂的互作关系， 稻瘟病菌侵害促进了水稻抗性基因的进化与形成， 而外界自然因素的影响又迫使稻瘟病菌不断突变以应对水稻的防御，同时大量抗性基因也未得到充分利用，目前的研究，也只是冰山一角， 为了进一步解析水稻与稻瘟病菌的互作机理， 更加高效地利用抗性基因为稻瘟病抗病育种服务， 以下几方面还需要开展进一步研究：①继续开展抗性基因与无毒基因互作的分子机理研究， 探明二者互作的下游信号途径。 ②继续解析水稻广谱抗性基因的分子机理， 为基因的利用提供理论依据。 ③开发更有效、与抗性基因紧密连锁的分子标记， 促进抗性基因在育种中的利用，提高育种分子化水平。 ④挖掘抗稻瘟病种质资源，发掘新的抗稻瘟病基因。充分利用分子标记辅助育种技术、 转基因技术和基因编辑技术等作物育种技术，简化育种程序，提升育种效率，获得更多的广谱抗性新品种， 切实提高我国的稻瘟病绿色防控水平。