基于脑脊液常规的细胞学检查在中枢神经系统疾病诊断中的应用进展

高 悦 张彩霞 李桐桐 王 涛

1 滨州医学院附属医院检验科 山东 滨州 256603；2 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603

中枢神经系统疾病是指因脑部和脊髓部位由于受到感染、先天遗传、外伤及新陈代谢障碍等多方面影响和因素所引起的一类疾病[1]。脑脊液常规检测(后称常规)是中枢神系统疾病诊断、鉴别诊断及疗效观察的重要手段之一[1]，其中，细胞分类正是常规的核心检查之一。然而，在临床工作中，大多数医院依然采用较为原始的显微镜分类法—经冰醋酸酸化后在高倍镜下对有核细胞进行单个核和多个核细胞进行分类计数(共计100个有核细胞)[1]。随着抗生素及各种诊疗措施的广泛应用，越来越多疾病的临床表现(包括症状及体征)变得复杂，缺乏典型特征，给临床诊疗工作带来很大的困难，常规已很难满足临床的诊疗需要[2]。如今，部分医院对脑脊液标本除进行常规细胞计数外，还附加一种新的脑脊液检查项目——脑脊液细胞学检查，即通过对收集的脑脊液细胞进行迈-格-姬 (MGG)染色，并在显微镜下对细胞及有形成分进行形态学分析，就如同对蛛网膜下腔的组织活检，反映蛛网膜下腔和脑膜的病变情况，从而对疾病作出诊断及疗效评估[2-3]。随着各种药物及治疗手段的介入，许多疾病的临床表现变得复杂多样 ，特别是常规白细胞计数正常的病例，给临床医生的诊断和鉴别诊断造成了很大困惑，而细胞学在这方面具有不可替代的作用[4]。本文将主要介绍细胞学在几种主要的中枢神经系统疾病中的特征表现，以证其重要的临床意义。

1 脑脊液细胞学检查的概述

脑脊液的细胞学检查是将脑脊液细胞经过收集和染色后对细胞形态学的观察和研究，能反映机体因各种病因引起病理变化时的细胞学表现,可用于中枢神经系统疾病的诊断、病情监测、疗效评价和预后判断。由于许多中枢神经系统疾病的病理生理学改变只发生在脑脊液中，故脑脊液细胞学检查就显得尤为重要。

1.1 细胞收集 脑脊液细胞学检查已经开展了百余年，但因为脑脊液中细胞数量较少，加之细胞收集装置的限制，使得长久以来检验人员只能使用较为原始的血细胞计数版进行不精确的检查。直至 1954 年Saky发明了脑脊液细胞玻片离心沉淀器, 将细胞直接收集在玻片上进行固定和染色检查的新方法后, 脑脊液细胞学检查才得到了快速发展, 并获得了较理想的临床效果[5]。1962年，在南京医学院侯熙德教授首先引进的新型玻片离心沉淀法脑脊液细胞学方法后[6]，随着国内学者的不断努力，粟氏FMMU-5微型(1981年)和孔氏FCS两用型(1993年)细胞玻片离心沉淀器相继研制成功[7]。现如今，大多是使用脑脊液玻片离心沉淀仪进行细胞收集工作。该项检查技术对中枢神经系统感染性疾病的诊断具有较好的临床应用价值，检查方法简便、易行，而且也非其他检查方法所能完全替代的。

1.2 细胞染色 临床上常用MGG染色法对脑脊液细胞进行染色。MGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。

此外,一些特殊的染色方法也有一定的补充和拓展作用，如吖啶橙荧光染色法和DNA染色法对癌细胞的辨认及其活力状态的判断、酸性非特异性酯酶活性(ANAE)染色法对脑脊液T细胞的辨认及脑脊液免疫功能的快速检测、高碘酸雪夫(PAS)染色法对癌细胞和淋巴母细胞的鉴别、过氧化酶染色法对形态相似的幼稚白细胞的鉴别、脂类染色法对脂类吞噬细胞的鉴别、硝基四氮唑蓝染色法对成熟和幼稚的中性粒细胞的鉴定等。随着技术的发展，包括免疫组化染色在内的一些新型染色方法不断出现。有学者[8]称，免疫组化染色是脑脊液细胞学常规染色的补充，能有效弥补常规染色对肿瘤细胞鉴定困难的不足，特别对于脑膜癌病的诊断具有重要意义。

2 在疾病诊断中的应用

脑脊液细胞学检查是多种中枢神经系统疾病的诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后判断所必需的方法之一，包括中枢神经系统感染、中枢神经系统肿瘤、中枢神经系统白血病和脑血管病等。

2.1 中枢神经系统感染 中枢神经系统感染是各种病原微生物侵犯脑或脊髓实质、被膜和血管等引起的急、慢性炎症性疾病，也是神经系统的常见病。根据病原微生物的不同，该病主要分为细菌性感染、病毒性感染、结核性感染、霉菌性感染和寄生虫性感染五类。中枢神经系统感染是神经系统的常见疾病，也是严重威胁人类健康的感染性疾病。脑脊液是由脑室脉络丛产生，正常脑脊液中单核细胞与淋巴细胞比例约为7∶3，当中枢神经系统发生感染时，其内细胞种类和比例会发生相应变化。而脑脊液细胞学则是一门对正常和病理状态下脑脊液细胞成分进行分析的科学，尤其是精确的细胞分类和动态脑脊液细胞学的观察，对了解中枢神经系统疾病的病理过程和协助诊断中枢神经系统感染性疾病起了很大的作用，还可通过CSFC演变过程的分析来评估治疗的效果。

2.1.1 化脓性脑膜炎 化脓性脑膜炎(细菌性脑膜炎)一般为急性或亚急性起病，以发烧头痛恶心呕吐等脑膜刺激征为临床表现。一般分为三个时期：急性期该期细胞总数大量增加，常达103～104/mm3。以中性粒细胞为主，可占白细胞总数的90%及以上，还伴有少量大淋巴样细胞、大单核细胞以及浆细胞等。早期细胞较为幼稚，以杆状核细胞为主，但时间较短，很快演变为分叶核粒细胞，并且该粒细胞吞噬能力较强，可在其胞浆内发现病原菌并在其作用下逐渐转化成脓细胞；亚急性期经过有效抗生素等药物治疗，细胞总数和中性粒细胞数会逐渐下降，淋巴、单核样细胞明显增多，大淋巴细胞、激活单核细胞及浆细胞出现；恢复期经过不断治疗，细胞总数接近正常，嗜中性粒细胞消失，以各种淋巴细胞(大淋巴细胞、小淋巴细胞和激活淋巴细胞)为主，激活单核细胞较前减少，浆细胞消失。若病情进一步好转，则细胞总数及细胞比例恢复正常。

在与结核性脑膜炎的鉴别方面，结核性脑膜炎的基本细胞学表现是以中性粒细胞和淋巴细胞为主的混合细胞反应。而由于抗生素的广泛使用，许多患者就诊时就进入亚急性期，故两种疾病容易混淆[9]。有研究[10]称化脓性脑膜炎的演变明显快于结核性脑膜炎。所以对于初次脑脊液检查结果为混合细胞反应而临床怀疑化脓性脑膜炎，应注重其脑脊液细胞学动态检查，根据演变的速度加以鉴别—若演变速度快，则提示化脓性脑膜炎，反之则需要排除其他类型脑膜炎的可能。

2.1.2 病毒性脑膜炎 病毒性脑膜炎常由多种病毒引起，其中以由肠道 Ev71病毒和单纯疱疹病毒为主，起病急，好发于儿童。

病毒性脑膜炎患者的细胞总数常达50～500/mm3，脑脊液中会出现来自外周通过血脑屏障进行免疫应答的免疫活性细胞，根据细胞种类变化大致分为以下几个时期：①超早期(发病3 d内)可见中性粒细胞一过性增加，常达50%以上，呈混合细胞型反应；②急性期(发病3 d后)出现大量淋巴细胞(可占白细胞总数的80%～90%)和少量单核细胞，可见转化型淋巴细胞、淋巴样细胞和浆细胞，粒细胞明显减少；③亚急性期(发病1周后)与急性期相似，中性粒细胞明显减少甚至消失；④恢复期(发病2～3周)表现为混合细胞型反应，以淋巴细胞为主。若异常细胞消退，正常细胞出现并接近正常水平时提示病情康复。

在鉴别诊断方面，病毒性脑膜炎应与结核性脑膜炎做好鉴别。结核性脑膜炎常被误诊为病毒性脑膜炎，误诊率达30%左右，且一旦误诊应用激素后会引起结核杆菌全身播散，后果极为严重[11]。病毒性脑膜炎的细胞学表现一般呈淋巴细胞反应，而结核性脑膜炎则是以中性粒细胞反应或以中性粒细胞为主的混合细胞反应。值得注意的是，病毒性脑膜炎超早期(3 d内)会出现一过性的中性粒细胞增加[12]。所以要做到两者的有效鉴别，要注意患者起病3 d后的脑脊液细胞学表现，再结合临床症状、脑脊液生化、影像学进行进一步的评估，最大限度地提高早期确诊率。

2.1.3 结核性脑膜炎 结核性脑膜炎是最严重的肺外结核病，其病死率和致残率居高不下[13]。有文献[14]报道,早期确诊并快速启动治疗是改善结核性脑膜炎预后的关键。但由于一方面抗酸染色等病原学检查阳性率低[15]，另一方面其临床表现和脑脊液生化检查越来越不典型的特点[16]，共同导致了结核性脑膜炎的误诊率增加，早期诊断困难。

结核性脑膜炎细胞总数常达(100～1000)× 106/L。起病早期，可出现中性粒细胞比例升高。结核性脑膜炎常呈现多种细胞并存的混合细胞反应，并且短时间内保持稳定，通常以淋巴细胞为主的混合细胞反应最为常见，这是结核性脑膜炎在细胞学上最显著的特征。此时，脑脊液细胞学并不典型，混合细胞反应可以淋巴细胞为主，也可以单核细胞为主，细胞总数也不高，难以与病毒性脑膜炎鉴别，易造成误诊，而一旦误诊应用激素后会引起结核杆菌全身播散，后果极为严重[17]。随着病情进展，其中性粒细胞比例逐渐下降，而淋巴细胞核单个细胞的比例则增高。脑脊液细胞学检查也是结核性脑膜炎病情监测最重要的指标之一，若中性粒细胞减少或消失，提示预后良好；若持续混合型细胞反应，提示预后不良；若再度出现大量嗜中性粒细胞，则提示病情加重或复发。

有研究提出的改良抗酸染色法使检测的敏感度从传统离心涂片法的 3.3%提高到 82.9%，诊断效率极大提高[18]；还有报道称创新的聚合酶链反应检测技术是提高诊断中枢神经系统结核病的敏感方法[19]；在细胞染色方面，对脑脊液单核细胞内结核抗原进行免疫组化检测可进一步提高检测的特异性[20]。

2.1.4 霉菌性脑膜炎 霉菌性脑膜炎最常见的致病菌为新型隐球菌。隐球菌为条件致病菌，主要经呼吸道传播。当宿主免疫功能低下时经血流播散到中枢神经系统引起隐球菌性脑膜炎。由于隐球菌性脑膜炎的临床表现、脑脊液常规检查及影像学检查缺乏足够的特异性，故病死率仍在20%～30%[21]。

在脑脊液中找到隐球菌是隐球菌性脑膜炎确诊的依据，所以病原学检查是诊断隐球菌性脑膜炎的关键。目前来说，主要的检测隐球菌的方法有墨汁染色、乳胶凝集试验和脑脊液细胞学检测等。其中，墨汁染色法简单易行，国内报道其阳性率可达80.0%。但由于直接涂片墨汁染色涂片不均匀、杂质污染等缺点可能造成阳性率降低, 有报道通过 13 ～19 次墨汁涂片才找到隐球菌[22]；关于乳胶凝集试验，有报道[23]称，其检测隐球菌多糖抗原的敏感性与特异性均可达 90.0%以上，但同时也有报道，由于受血清中类风湿因子的影响可能会导致假阳性反应，乳胶凝集实验特异度只有 56.5%[24]，存在较多假阳性，所以乳胶凝集实验的特异度还有待观察；有报道[24]称，脑脊液细胞学检查较传统的墨汁染色 法及乳胶凝集实验更有优势，且更直接，是一种先进的快捷便利的方法，能对隐球菌性脑膜炎快速做出敏感度和特异度较高的诊断。

2.1.5 脑寄生虫病 寄生虫脑病的细胞学特征是以嗜酸性粒细胞增多为主,常在4%～10%左右,最高可达60%及以上。寄生虫病原体的检出率很低。在寄生虫脑病急性期可出现一过性中性粒细胞增加，但一般持续时间较短。

2.1.6 新进展 近十年，国内外学者在普通光镜镜检的细胞学基础上，与电镜技术、环介导的等温扩增(LAMP) 技术、流式细胞术等技术相结合，使得诊断的可靠性大大提升[25]。其中LAMP技术可以实现对单纯疱疹病毒性脑炎的早期诊断[26]，而流式细胞术可对中枢神经系统炎症患者的血液和脑脊液的淋巴细胞亚群的比例进行分析[27]。

2.2 中枢神经系统肿瘤 中枢神经系统肿瘤患者的脑脊液中可发现肿瘤细胞，其特点是“体大核大”，核浆比例失调，细胞着色很深；细胞有丝分裂活跃,常呈团、簇或花瓣样、腺管状排列并且胞膜界限不清，易与其他细胞鉴别，也可通过一些特殊染色方法辅助鉴别。如应用 AO染色检测法观察核酸的变化来判断细胞的良恶性程度，应用PAS染色法可将组织中的黏多糖类物质染成樱桃红色, 从而判定肿瘤细胞是否分泌糖原并推断出肿瘤细胞的起源, 用于某些肿瘤的诊断和鉴别诊断[28]。值得注意的是，对于脑膜癌，其多位于硬膜内面及软脑膜上, 呈颗粒性广泛分布。因其太薄，故CT和MRI多为阴性[29]，故漏诊率较高。其肿瘤细胞检出率较高，而脑脊液细胞学就成为了这种情况下的有效检查方法，作为影像学检查的补充方法。

尽管随着技术的发展，对于肿瘤有许多进一步检查，如查肿瘤标记物、PCR 扩增技术、单克隆抗体检测、免疫组化及流式细胞检测技术[30]等，然而用 CSF 细胞学方法鉴别 CSF 中脑脊髓膜癌转移细胞仍是金标准[31]。

脑脊液细胞学对于中枢神经系统肿瘤的诊断、病情监测和疗效评价具有重要意义，是影像学检查的重要补充，并且把对于脑膜癌病等的确诊从过去的术后或死后病理诊断发展到术前或生前即可确诊的新阶段。

2.3 中枢神经系统白血病/淋巴瘤 中枢神经系统白血病是白血病细胞浸润脑膜、脑神经、脑组织及脊髓等的总称，其中以蛛网膜和硬脑膜最为多见。淋巴瘤是非肿瘤性淋巴细胞在中枢神经系统反应性集聚所致。免疫系统多以多克隆形式反映，但脑组织免疫功能较为缺乏，在慢性抗原的刺激下，逐渐变为单克隆增殖，成为淋巴瘤。

脑脊液中瘤细胞的细胞学特点与外周原发白血病和淋巴瘤细胞基本相同，故易辨别，但两者也有一定区别：前者有恶性细胞特征(核仁较大，胞浆空泡较多等)，而后者没有。脑脊液中出现白血病细胞或淋巴瘤细胞是中枢神经系统白血病/淋巴瘤诊断的特征性改变。部分以中枢神经系统损害为首发症状就诊的白血病患者，甚至可以出现经脑脊液细胞学检查发现，骨髓确诊，而外周血却找不到幼稚细胞的情况。所以脑脊液细胞学检验是该疾病诊断的金标准。

2.4 脑血管病 蛛网膜下腔出血主要分为3个时期。急性期以大量红细胞和中性粒细胞为主。其中中性粒细胞比例在70%以上，48～72 h达高峰，一周后逐渐消失。吸收期出血 3～7 d即可见到红细胞吞噬细胞和含铁血黄素吞噬细胞—蛛网膜下腔出血的特征性细胞，在吞噬细胞胞浆内的含铁血黄素吞噬细胞被 MGG 染成灰黑色或棕黑色颗粒。同时，激活单核细胞增多，持续持续2～3周。恢复期激活单核细胞增多，可持续数周到数月。

吞噬细胞常可持续数周或数月，以清除脑脊液内红细胞及其分解产物。若脑脊液中红细胞吞噬细胞消失，只有含铁血黄素吞噬细胞及胆红质吞噬细胞，则提示脑出血已停止；若一次出血后同时见吞噬新鲜红细胞，褪色红细胞，含铁血黄素和胆红质的吞噬共存，则提示出血未止或有再出血的可能。缺血性脑病患者的脑脊液中除偶见少量红细胞外，一般没有其他细胞学异常。

3 小结

脑脊液细胞学检查在五种中枢神经系统感染诊断与鉴别、两种脑血管病的诊断与鉴别、病理性出血和穿刺误伤的鉴别、中枢神经系统肿瘤的诊断、中枢神经系统白血病和淋巴瘤的诊断以及多种中枢神经系统疾病的疗效评价及预后判断都有着重要的临床价值。

尽管脑脊液细胞学发展迅速，但依然有不少问题噬待解决。我们认为今后脑脊液细胞学发展路线应该从以下三方面开展：①结构研究，明晰细胞、亚细胞、分子乃至量子的内部结构,才能阐明生命的本质，只有从结构入手才能理解其功能；②信息研究，信息流是生命现象的一项重要活动以及外界信息对细胞的影响(胞膜从胞浆至胞核)；③层次研究，大分子、细胞、细胞间直至人体是几个主要的不同层次结构,任何一个层次的研究都离不开整体的综合和归纳。