Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞分化与股骨头坏死发病的相关性

付志斌王鹏志张秀琴

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000

非创伤性股骨头坏死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）通常是由于股骨头部位血液供应障碍，局部微循环障碍，致使骨髓细胞和骨细胞死亡，导致骨坏死，随之坏死部分塌陷，引起关节功能障碍，影响患者生活质量。随着物质生活的持续丰富，饮酒、吸烟、长期高剂量使用激素在日常生活中，这些不良生活习惯导致NONFH的发病率逐年升高，15岁以上人群中大约有800万NONFH患者［1］。目前认为，NONFH与血管内皮损伤、微循环障碍和骨代谢紊乱致使成骨细胞减少与凋亡相关［2，3］，其作用机制与Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）多向分化有密切联系，本文就Wnt信号通路与BMSCs分化的相关研究进展做一综述，并探讨其与NONFH发病的相关性，以期为NONFH的防治提供新的思路。

1 BMSCs生物学特性

BMSCs存在于大多数胎儿和成人组织中，可在骨髓、脐带血、胎盘、牙髓、脂肪组织和滑膜等组织中广泛获取。一方面，它是一种多能干细胞，可在体外增殖并向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞等多向分化［4，5］；另一方面，其分化潜能、体外扩增、组织修复、免疫调节、易获性等，使BMSCs成为各种先天性和后天性疾病的理想治疗方法［6］。虽然BMSCs存在体外复制衰老，从而限制了细胞扩增数量，但就其在再生医学和生命科学的前景，仍让众多医疗工作者对其治疗早中期NONFH充满新的希望。

2 Wnt信号通路

Wnt信号通路是由配体蛋白Wnt、膜蛋白受体、胞内信号传递成分、胞内转录调控成分组成，包括经典Wnt信号通路（Wnt/β-catenin信号通路）和非经典Wnt信号通路（平面细胞极性通路、Wnt/Ca+通路等）。Wnt配体蛋白通过激活细胞表面相应受体，诱导细胞极化，并激活其谱系特异性信号通路，进而对下游信号通路产生调控作用［7］。该信号通路广泛存在于多细胞生物进化过程中且极具高度保守性与细胞依赖性，对细胞增殖、生长有较为重要的调控作用。有研究证明，其对骨细胞的增殖和分化、新生血管形成、炎症反应也具有一定的调控作用［8］。

3 影响Wnt信号通路与BMSCs分化的因素

3.1 蛋白与基因的调节

3.1.1 脂联素。脂联素（adiponectin，APN）主要是由脂肪细胞合成并向血液中分泌的多功能激素蛋白［9］。研究表明，APN可通过自分泌或旁分泌途径、内分泌途径影响胰岛素信号通路作用于成骨细胞和破骨细胞进而影响骨代谢［10］。Wang Y等［11］在BMSCs分化过程中检测到AdipoR1和AdipoR2的表达，重组了含有人APN基因的腺病毒，然后在体外将该腺病毒转染到BMSCs或将其注入动物模型的骨缺损区域，最后通过实时荧光定量PCR，免疫印迹与荧光，HE染色和显微CT检测到Wnt/β-catenin信号通路激活、成骨相关基因/蛋白表达增加和新骨形成，从而证明APN可以通过Wnt/β-catenin途径促进BMSCs成骨分化和骨形成。

3.1.2 基因。MicroRNA（miRNA）是由多个核苷酸组成的内源性小分子非编码RNA，在真核生物中可调节30%的基因表达。其通过靶定到mRNA3’非翻译区来调节基因的表达，提示miRNA可为基因表达提供一种快速准确的调节机制，因此，miRNA调控网络的错乱，将引起多种疾患，如免疫性疾病、心血管疾病、癌症、骨关节疾病等难治愈性疾病［12-15］。最近研究表明，miRNA是诱发NONFH最重要的影响因子之一，其表达量改变能造成严重的病理状态［16］。而miRNA密切参与控制BMSCs成骨细胞分化的关键步骤，这为治疗NONFH提供了新的方向［17］。miR-30e表达抑制可促进成骨细胞转录因子Runx2、Osx、Ocn、ALP和BSP的表达，同时抑制脂肪细胞的分化，增强成骨细胞的分化。LRP6是Wnt/β-catenin信号通路的关键辅助受体和miR-30e的直接靶标，miR-30e通过抑制LPR6的表达来阻断Wnt/β-catenin信号通路传导，从而抑制BMSCs的多向分化［18］。Wang H等［19］在体外细胞培养实验中证明miR-101通过靶向ezh2（mir-101的靶基因）激活了Wnt/β-catenin信号通路，而β-catenin抑制剂ICG-001抑制了β-catenin的表达。阻断Wnt/β-catenin信号通路的传导，从而逆转了miR-101的促进作用，抑制BMSCs成骨分化，最终影响体内骨形成。因此，可证明miR-101可通过靶向ezh2/wnt/β-catenin信号通路来促进成骨分化。Long H等［20］探讨miR-139-5P和ALP在BMSCs成骨分化中的作用，通过检测成骨基因的表达和ALP活性发现抑制miR-139-5P能显著促进BMSCs向成骨细胞分化，其作用机制可能是通过miR-139-5P靶向Wnt/β-catenin信号通路的关键因子CTNNB1和Frizzled4（FZD4）在BMSCs成骨中发挥作用。

3.2 药物有效成分与激素调节

3.2.1 小檗碱。中药黄连的主要有效成分为小檗碱（Berberine，BBR），在临床中常作为抗炎、抑菌、调脂等药物［21］。现研究发现，BBR可通过促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞生成、骨吸收以及抑制脂肪生成而广泛用于骨关节疾病。在诸多信号通路当中，Wnt信号通路在NONFH中研究颇多，参与调控骨代谢紊乱，维持成骨细胞与破骨细胞含量比，β-catenin、Runx2、DKK-1、β-catenin SiRNA等是Wnt信号通路的关键组成成分［22］。Tao K等［23］通过研究发现，BBR可激活Wnt/β-catenin信号通路，促使β-catenin进入细胞核，与Runx2启动子上的TCF1形成复合物，随后上调Runx2靶基因OPN和OCN表达，促进BMSCs向成骨分化，抑制成脂作用，最终增强BMSCs的成骨分化。

3.2.2 黄酮类化合物。黄酮类化合物是植物新陈代谢重要的次生代谢产物，包括黄酮、黄酮醇、黄烷醇、异黄酮和花色素等，具有影响血液流变、抗氧化、改善微循环、抗缺氧、抗炎、降低血管脆性等多种药理作用［24］。黄酮类化合物可通过雌激素受体（ER）信号通路、BMP-2/Smads/Runx2/osterix信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路、NF-κB信号通路等影响成骨细胞分化［25］，其中Wnt/β-catenin信号通路可通过促进BMSCs向成骨细胞分化、减少成脂细胞分化，增加新骨生成量，从而延缓甚至逆转早中期NONFH。Gu Q等［26］在体外培养细胞实验中使用传统中药银杏叶（GBE）刺激BMSCs分化，通过检测BMP4、Runx2、β-catenin和细胞周期蛋白D1含量，发现这些检测指标在GBE促进BMSCs成骨过程中显著增加。同时，使用信号抑制剂进行功能丧失试验，证实了BMP和Wnt/β-catenin信号通路在骨形成过程中至关重要。这表明，GBE可通过激活BMP和Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs向成骨细胞分化以提升骨形成量。Ying X等［27］探讨杨梅黄酮类化合物对体外培养的BMSCs成骨分化的影响，使用MTT比色法、茜素红S染料、碱性磷酸酶（ALP）活性测定、实时荧光定量PCR和Western blot分析评价成骨分化情况，发现杨梅黄酮类化合物能增强BMSCs分化过程中ALP活性、Runx2的mRNA表达和矿化作用。同时，杨梅素可激活Wnt/β-catenin信号通路，增加下游靶基因Runx2的表达，进而说明杨梅黄酮类化合物通过激活Wnt/β-catenin信号通路来增强BMSCs的成骨分化。

3.2.3 神经激素。神经激素是确保骨吸收和骨形成平衡的因素之一，其对骨代谢的影响是双向的，取决于体内激素含量的高低，当下丘脑β1和β2肾上腺素能系统激活时，骨组织中的β2受体激活骨形成并增加骨吸收；但是当外周β2受体慢性刺激时，可加快骨丢失并改变骨骼硬度。对骨代谢具有确切调控作用的神经激素有神经肽Y（NPY）和神经酰胺U等［28，29］。NPY作为一种调节信号功能的激素，可在部分细胞和组织中促进BMSCs向成骨和成血管化分化。Wu J等［30］在诱导细胞增殖和抗凋亡过程中，发现NPY可激活Wnt/βcatenin信号通路，提高β-catenin和c-myc蛋白的基因和蛋白表达水平；同时，发现DKK1可抑制NPY的增殖和抗凋亡活性，DKK1还可阻断β-catenin、PGSK-3β和c-myc蛋白的mRNA和蛋白表达。因此，此研究的结果表明，NPY在体外以适宜剂量通过Y1受体介导，并参与Wnt/β-catenin信号通路的激活，发挥对BMSCs增殖和保护作用。总之，神经肽物质可以通过促进β-catenin和c-myc等蛋白质和基因的表达以及促进β-catenin的核转位来激活Wnt/β-catenin信号传导，提高BMSCs的存活率，进而发挥BMSCs成骨分化潜能［31］。

3.3 其他Sirtuin 1（sirt1）是调节BMSCs成脂和成骨分化的关键因子，其过度表达可抑制sfrp1、sfrp2和dact1的mRNA表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制BMSCs成脂细胞的基因转录，从而减少成脂细胞分化，增加成骨细胞分化［32］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（pparγ），是配体诱导核受体的核激素家族成员之一，参与诸多细胞内的代谢过程，与骨代谢密切相关的BMP和Wnt，通过Wnt/β-catenin信号通路抑制pparγmRNA的表达，而其余Wnt信号通路通过激活组蛋白甲基转移酶，抑制pparγ的转录激活，从而抑制BMSCs向脂肪细胞分化［33，34］。

4 小结

BMSCs具备多向分化，易获得，快速增殖，低免疫原性和高便携性的能力，可以作为治疗NONFH的理想种子细胞。因此，通过研究Wnt信号通路调控BMSCs多向分化的不同诱导因素，从而充分发挥BMSCs向成骨细胞和血管内皮细胞分化的潜能，有研究发现，上述的多种蛋白及基因在NONFH的发病中也具有一定的调控作用［13］，所以二者存在一定的相关性。但是，同时也存在亟待解决的新问题：由于股骨头坏死部位血液供应不足，细胞存活缺失营养和自由基的产生导致移植的BMSCs活力降低；存在许多与骨代谢相关的信号通路，彼此之间相互作用、错综复杂，故还需进一步研究各种诱导因素如何通过Wnt信号通路促使BMSCs向成骨分化的分子信号机制，对其机制的明确阐述有助于进一步发现NONFH的发病机制，从而为股骨坏死的防治发挥关键作用。为再生医学和生命科学开辟新的领域，为科学研究和临床医生提供治疗NONFH的新思路，为NONFH患者带来减轻疾病疼痛的新希望。