巨噬细胞在骨骼肌损伤再生中的研究进展

程建红，洪莉，洪莎莎，汤剑明

(武汉大学人民医院妇产科，武汉 430060)

骨骼肌损伤最常见于交通事故和运动损伤中，骨骼肌是机体最具再生能力的组织之一，在骨骼肌受到损伤(牵拉、撕裂、钝挫等)后数月，其形态和功能可在一定程度上恢复至正常。骨骼肌惊人的再生能力主要依赖于骨骼肌干细胞，即肌卫星细胞的修复能力[1]。骨骼肌受到损伤时，处于静止状态的肌卫星细胞激活并增殖形成成肌细胞，成肌细胞相互融合分化为多核肌管，肌管新生或与幸存的组织相互融合形成肌纤维，完成骨骼肌损伤后的再生过程。骨骼肌受到损伤立即触发高度协调的再生过程，构成由免疫细胞、炎症细胞以及调节肌卫星细胞增殖和分化的细胞因子等组成的复杂交织的“卫星细胞龛”。可见，骨骼肌损伤后的再生过程需要不同细胞群之间的协调作用[2]，其中巨噬细胞在骨骼肌损伤再生过程中发挥不可或缺的作用，是骨骼肌损伤再生中不同生物学过程的关键调节者，参与炎症、骨骼肌再生、组织重构和血管生成等过程[3-6]。骨骼肌损伤性疾病一直是全球主要的公共卫生问题，缺乏真正有效的治疗策略，骨骼肌损伤后的再生研究领域受到广大科研工作者的广泛关注。现对骨骼肌损伤再生过程中巨噬细胞的潜在功能以及巨噬细胞与其他细胞间的相互作用予以综述，以期为骨骼肌损伤后再生过程以及骨骼肌损伤性疾病的研究和治疗提供参考。

1 骨骼肌中巨噬细胞的概述

1.1骨骼肌损伤再生中巨噬细胞的来源 巨噬细胞参与骨骼肌损伤后的再生过程，其来源主要有两种，一种是长期存在于骨骼肌中的固有巨噬细胞，终生静息存留在健康骨骼肌内，在骨骼肌发生病损时发挥作用[7]；另一种是骨骼肌损伤后来源于骨髓的浸润巨噬细胞，在骨骼肌病变时侵入骨骼肌。骨骼肌固有巨噬细胞源自胚胎期的卵黄囊，成年后定植于骨骼肌中，可通过原位增殖进行自我更新补充[8]。从外周循环招募的浸润巨噬细胞由造血干细胞经由单核细胞分化形成。与浸润巨噬细胞不同，骨骼肌固有巨噬细胞不具有吞噬能力[9]。骨骼肌固有巨噬细胞被认为是一种“哨兵”，容易被骨骼肌损伤时分泌的损伤相关分子模式激活，具有促进其他炎症细胞募集的功能。目前，尽管固有巨噬细胞的起源和组织特异性功能已在许多其他组织中得到广泛研究，但它们在骨骼肌中的特征尚不明确，其在骨骼肌损伤再生中的潜在作用需要进一步研究。

1.2骨骼肌损伤部位巨噬细胞的募集及对炎症反应的调节 巨噬细胞是骨髓和外周淋巴组织中的主要髓系细胞，在骨骼肌损伤后炎症初期，从外周循环募集至损伤部位成为骨骼肌中的炎症性巨噬细胞。首先，源自骨髓活化的单核细胞黏附在血管内壁上，滚动并迁移至损伤部位，在损伤部位进一步分化发育成巨噬细胞。单核细胞根据不同的渗出机制和Ly6C蛋白表达水平，可分化成两种不同功能状态的巨噬细胞亚群，即Ly6Chi巨噬细胞亚群和Ly6Clo巨噬细胞亚群[10-11]。通过CC趋化因子受体2招募的Ly6Chi巨噬细胞在炎症早期率先募集，表现为促炎特性。而依赖于CX3C趋化因子受体1招募的Ly6Clo巨噬细胞则较晚出现，表现出抗炎特性。

骨骼肌损伤后24 h内，外周循环中的Ly6Chi巨噬细胞侵入骨骼肌损伤部位，其数量显著增加，并持续增加至伤后2 d。骨骼肌损伤后第2天开始，Ly6Chi巨噬细胞数量开始减少，Ly6Clo巨噬细胞开始聚集，随后几乎所有的LyC6hi巨噬细胞都被Ly6Clo巨噬细胞取代，Ly6Clo巨噬细胞数一般在伤后4 d时达到最高峰，并在数天内维持在较高水平[11]。Ly6Clo巨噬细胞参与骨骼肌再生的后期阶段，即新肌纤维的形成和生长、组织重构、血管生成等[12]。一旦肌纤维再生结束且恢复至稳态，巨噬细胞数量降至正常水平。与此同时，巨噬细胞停止分泌促炎因子或抗炎因子，转为一种向内稳态回归的沉默模式[3]。Arnold等[11]发现，在骨骼肌再生的初始阶段，阻断单核细胞进入骨骼肌损伤部位可减轻炎症反应，但同时会延迟且减少Ly6Chi巨噬细胞的募集，进而阻碍Ly6Clo巨噬细胞的正常募集和作用发挥，最终导致肌肉无效再生。由此可见，Ly6Clo和Ly6Chi巨噬细胞在骨骼肌损伤再生过程中有效和有序的募集是骨骼肌损伤后再生的关键，两者缺一不可。因此，过度的抑制炎症不利于骨骼肌的再生。

骨骼肌损伤后首先发生炎症反应，巨噬细胞参与骨骼肌损伤后炎症反应的全过程，即炎症的发生、发展和消退是协调炎症细胞聚集和发挥功能的关键细胞。炎症开始时，定植于骨骼肌中的固有巨噬细胞被激活分泌中性粒细胞趋化因子1、单核细胞趋化因子1促进中性粒细胞和单核细胞的募集[6]。同时，黏附于血管内皮细胞上的巡逻单核细胞在骨骼肌损伤后1 h内迅速到达骨骼肌损伤部位，分泌大量的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，促进中性粒细胞的募集[13]，此外，巡逻单核细胞还可通过与中性粒细胞直接物理接触延长中性粒细胞在损伤部位的停留时间，使中性粒细胞充分发挥吞噬作用，清除骨骼肌坏死组织碎片以及释放促炎症因子扩大炎症反应[14]。

骨骼肌损伤后中性粒细胞在2 h内迅速到达损伤部位，数量迅速增加，伤后6～24 h达到最高峰，然后数量急剧下降。中性粒细胞到达损伤部位后通过吞噬作用释放活性氧类、蛋白酶，刺激宿主启动防御功能并清除病变坏死组织细胞碎片[15]。因此，在骨骼肌再生过程中，缺失中性粒细胞会导致坏死组织持续存在，进而造成骨骼肌再生延迟[16]。此外，中性粒细胞通过分泌巨噬细胞炎症因子1和单核细胞趋化因子1刺激炎症发展，并通过上述细胞因子招募外周循环中的单核细胞至骨骼肌受损部位[17]。随后，Ly6hi巨噬细胞大量渗入骨骼肌受损部位，并通过分泌促炎因子[如TNF-α和白细胞介素(interleukin，IL)-6]进一步促进中性粒细胞和单核细胞的募集[17-18]，这种促炎环境在损伤后48 h左右达到高峰；此后，Ly6lo巨噬细胞成为再生骨骼肌中的主要巨噬细胞亚群抑制炎症的发展。

骨骼肌损伤后第5天炎症进入消退阶段，炎症消退不是由促炎信号减少引起的被动过程，而是多种细胞和细胞因子参与的主动过程[19]。Ly6lo巨噬细胞分泌大量的抗炎因子，如IL-4、IL-13，积极促进炎症的消退。除可以减少促炎信号和活性氧类的产生外，上述细胞因子还可以阻止中性粒细胞的募集，促进中性粒细胞的凋亡以及巨噬细胞的非炎性吞噬[19]。总之，巨噬细胞始终在炎症发生、发展、消退中起着核心作用。

2 巨噬细胞调控肌卫星细胞的再生能力

巨噬细胞在骨骼肌再生过程中参与调节肌卫星细胞的增殖和分化。Saclier等[20]体外实验证实，巨噬细胞的条件培养基在体外可触发成肌细胞增殖，在体内可促进骨骼肌再生。此外，Juhas等[21]对体外构建的3D骨骼肌模型的研究发现，巨噬细胞是组织损伤后修复所必需的，巨噬细胞具有刺激骨骼肌再生的重要作用。Arnold等[11]进一步研究发现，Ly6hi巨噬细胞通过释放促炎细胞因子促进成肌细胞增殖，进而抑制其分化，Ly6lo巨噬细胞释放的抗炎细胞因子抑制成肌细胞增殖而刺激其分化和融合。目前，调控肌卫星细胞功能的旁分泌因子的具体成分尚未明确，然而，巨噬细胞分泌的部分细胞因子参与了调控肌卫星细胞的功能。如Ly6hi巨噬细胞高表达的细胞因子——IL-6[22]、TNF-α[23]和前列腺素E2[24]均刺激肌卫星细胞的增殖。且Ly6hi巨噬细胞分泌的去整合素样金属蛋白酶可减少Notch信号通路，从而促进肌卫星细胞激活和骨骼肌再生[25]。另一方面，Ly6lo巨噬细胞高表达的IL-4[26]和胰岛素样生长因子1[27]可刺激成肌细胞分化、融合和肌纤维生长。

综上所述，在肌肉损伤的早期阶段，浸润的Ly6hi巨噬细胞在肌卫星细胞增殖中起重要作用，而Ly6lo巨噬细胞在肌卫星细胞的分化中起重要作用。骨骼肌损伤后再生过程中，由于不同的巨噬细胞亚群对肌卫星细胞的作用不同，Ly6hi和Ly6lo巨噬细胞在时间和空间上紧密协调，在骨骼肌损伤后再生中具有重要价值。

3 巨噬细胞调节骨骼肌卫星细胞龛相关成分

骨骼肌干细胞(即肌卫星细胞)处于特殊微环境中，这种特殊微环境通常被称为“卫星细胞龛”。除调节肌卫星细胞增殖和分化的作用外，巨噬细胞还参与卫星细胞龛相关成分的调节。其中，巨噬细胞通过调控纤维/脂肪形成祖细胞(fibro/adipogenic progenitors，FAPs)的功能调节细胞外基质的产生，通过调控内皮细胞的功能调节血管的新生，进而促进骨骼肌损伤后的修复。

3.1巨噬细胞调节骨骼肌损伤后细胞外基质重构 除肌卫星细胞外，FAPs也参与了骨骼肌损伤后的再生，并对骨骼肌再生起至关重要的作用。在骨骼肌损伤后有规律的再生过程中，FAPs细胞数量在早期(1～3 d)增加，在晚期(4～7 d)减少。损伤后FAPs的增加对于细胞外基质成分的产生至关重要，细胞外基质成分是稳定组织所必需的，可作为新纤维的支架被肌卫星细胞用作基膜，以维持肌纤维的类似排列。当骨骼肌损伤时，FAPs可促进肌卫星细胞的激活和分化，而肌卫星细胞抑制FAPs向脂肪细胞的分化[28-29]。Lemos等[5]研究证实，Ly6hi巨噬细胞通过分泌TNF-α直接刺激FAPs的凋亡来调控FAPs的聚集。此外，Cordani等[30]体外实验发现，Ly6hi巨噬细胞分泌的一氧化氮抑制FAPs向脂肪细胞分化；而体内实验发现，其可减少骨骼肌内脂肪和结缔组织的沉积。在骨骼肌再生过程中，Ly6lo巨噬细胞可高表达转化生长因子-β，转化生长因子-β可阻断TNF-α诱导的FAPs凋亡，并诱导FAPs沿纤维化谱系分化。因此，Ly6lo巨噬细胞分泌的转化生长因子-β是FAPs在促炎反应后生存所必需的，这对骨骼肌愈合后期的组织重塑非常重要。Ploeger等[31]通过将成纤维细胞与不同亚群巨噬细胞共培养证实，Ly6lo巨噬细胞可促进成纤维细胞增殖和胶原合成，而Ly6hi巨噬细胞则通过分泌降解细胞外基质的酶，如基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶2减少胶原合成。

在骨骼肌损伤后的再生过程中，Ly6hi巨噬细胞和Ly6lo巨噬细胞之间的平衡和时间依赖性调控能通过FAPs调节细胞外基质的合成，在肌卫星细胞增殖和分化、新生肌纤维发生、骨骼肌正常修复中发挥作用。

3.2巨噬细胞调节内皮细胞功能 骨骼肌损伤后，血管细胞与肌卫星细胞通过相互作用促进血管新生，对骨骼肌损伤后恢复非常重要。内皮细胞通过分泌多种生长因子(如胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子)参与调控肌卫星细胞的生长，分化后的成肌细胞可反向刺激血管生成[32]。Birbrai等[33]发现，与毛细血管内皮细胞毗邻的周细胞亦具有刺激成肌细胞增殖的能力。

巨噬细胞具有调节血管新生的作用。Heil等[34]发现，CC趋化因子受体2缺陷小鼠中浸润的单核细胞的缺失损害了缺血后肢动脉侧支的形成，但不同亚群巨噬细胞在血管形成中的作用仍存在争议。肿瘤相关巨噬细胞是抗炎巨噬细胞的一个独特亚群，其具有明确的促血管生成作用[35]。然而，不同巨噬细胞亚群在非肿瘤形成环境中的作用不同。Zajac等[36]体外实验证实，抗炎巨噬细胞促进新生血管形成的作用较促炎巨噬细胞更强。Spiller等[37]的体外模型显示，内毒素和γ干扰素诱导刺激的促炎巨噬细胞促进血管出芽的长度和数量高于由IL-4和IL-13诱导刺激的抗炎M2a巨噬细胞，但低于由IL-10诱导刺激的抗炎M2c巨噬细胞。随后，Latroche等[38]将内皮细胞、成肌细胞和IL-4或IL-10诱导刺激的巨噬细胞体外共培养发现，抗炎巨噬细胞可通过分泌抑瘤素M调控血管新生和骨骼肌再生。总体而言，巨噬细胞在骨骼肌损伤后血管新生的调节中起重要作用；然而，不同巨噬细胞亚群的具体作用还需进一步研究的明确。

4 小 结

骨骼肌损伤后的惊人再生能力主要依赖于骨骼肌干细胞——肌卫星细胞，肌卫星细胞是骨骼肌损伤后再生过程中发挥作用的主要细胞，但仍需要其他细胞的协同作用，特别是巨噬细胞。骨骼肌损伤时，Ly6hi巨噬细胞通过放大炎症信号、吞噬组织碎片、产生细胞因子激活肌卫星细胞并促进其增殖。与Ly6hi巨噬细胞不同，Ly6lo巨噬细胞通过减弱炎症反应促进成肌细胞分化、融合和骨骼肌再生。此外，巨噬细胞还参与骨骼肌干细胞龛相关成分的调节，如通过调控FAPs功能调节细胞外基质的产生，或通过调控内皮细胞的功能诱导调节骨骼肌损伤后血管新生。现已证实，巨噬细胞在损伤骨骼肌中对肌卫星细胞和“卫星细胞龛”具有调节作用,但如何更好地利用巨噬细胞对肌卫星细胞及其细胞龛进行有效调控，使其在骨骼肌损伤再生过程中发挥最佳作用，还有待进一步研究探索。因此，进一步深入系统地研究巨噬细胞在骨骼肌损伤再生过程中的调控机制，将为探索出以调控巨噬细胞促进骨骼肌损伤再生为重要方向的治疗方法提供新的思路和靶点，可能成为今后研究的热点之一。