冠心病血瘀证“瘀毒”病机转变的蛋白质组学研究

尚青华，徐 浩，史大卓，陈可冀

冠心病(coronary heart disease，CHD)的二级预防是临床防治的重点，中医药在预防和治疗心血管疾病中发挥着非常重要的作用。血瘀证(blood stasis syndrome，BSS)贯穿于CHD发生、发展的始终，是其核心和关键证候要素。但在CHD稳定期病人转变为不稳定的过程中，中医病机发生怎样的改变还不清楚。

基于此，陈可冀院士团队在既往研究的基础上，提出心血管血栓性疾病“瘀毒”病因病机学说，制定了CHD稳定期病人“因毒致病”诊断及量化标准[1]，“热毒血瘀证”被纳入了国家中医药管理局2012年颁布的《22个专业105个病种中医临床诊疗方案》[2]，活血解毒治法已被临床广泛应用。陈可冀院士团队研制的活血解毒中药“清心解瘀方”已被证实可通过抗炎[3]、调控巨噬细胞凋亡[4]、重塑肠道菌群[5]等途径发挥抗动脉粥样硬化作用。临床研究也表明，在西医常规治疗基础上加用清心解瘀方可以减少稳定性CHD病人急性心脑血管事件，且安全性良好[6]。但CHD稳定期“瘀毒”是如何转化的、有何生物学基础，尚有待进一步阐明。

蛋白质组学是研究一个细胞、组织、器官或有机体在一定时间或一定状态下所表达的所有蛋白质，其研究重心是某一层次所有蛋白质及其动态变化规律，具有动态性、时间性、空间性、特异性、整体性等特点，与中医“证候”相似。不同证候之间的差异，必然有其相应的物质基础，证候蛋白质组学研究作为中医证候研究的重要手段，旨在揭示证候发生、发展规律和证候诊断的实质和生物学基础。蛋白质组学可以直接研究中医证候的特征与细胞蛋白质整体动态变化之间的内在联系，因而具有高效解码证候生物学基础的潜力，将是揭示证候实质的最有效手段，也为研究CHD稳定期“瘀毒”病机转化的生物学基础提供了技术支撑。

1 资料与方法

1.1 研究对象 中日友好医院、中国中医科学院西苑医院、首都医科大学附属同仁医院、首都医科大学附属安贞医院、福建中西医结合研究院门诊的CHD稳定期血瘀证病人，中日友好医院急诊科急性心肌梗死(AMI)病人。

1.2 诊断标准

1.2.1 CHD诊断标准 参照国际心脏病学会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》[7]，且既往有陈旧性心肌梗死病史或经冠状动脉造影检查证实至少有1支冠状动脉狭窄≥50%者。

1.2.2 AMI诊断标准 参照2001年中华医学会心血管分会《急性心肌梗死诊断和治疗指南》中AMI的诊断标准[8]。

1.2.3 中医辨证标准 参照中国中西医结合学会冠心病中医辨证标准[9]、中国中西医结合学会血瘀证诊断标准[10]和2012年《中西医结合杂志》发表的“冠心病血瘀证诊断标准研究”[11]。

1.3 纳入标准

1.3.1 CHD稳定期 ①年龄35～80岁；②符合CHD诊断，既往有陈旧性心肌梗死病史或经冠状动脉造影检查证实；③无明显心绞痛症状，或急性冠脉综合征稳定1个月以上。

1.3.2 AMI ①年龄35～80岁；②符合AMI诊断标准，即具备下列3项标准中的2项：缺血性胸痛的临床病史；心电图的动态演变；心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态改变。

1.4 排除标准 ①近1个月内有感染、发热、创伤、烧伤、手术史；②严重心力衰竭，射血分数(EF)<35%；③恶性肿瘤；④活动性风湿免疫性疾病、结核病；⑤肝硬化、肾衰竭或脏器移植；⑥严重慢性阻塞性肺疾病、呼吸衰竭或肺源性心脏病、右心衰竭；⑦严重血液系统疾病如白血病、再生障碍性贫血；⑧依从性较差或参加其他临床试验者。

1.5 剔除标准 ①入选后发现不符合纳入标准或具备排除标准；②入选后缺乏病史、症状、体征等主要记录，无法进行分析；③电话或地址变动，未能进行1年心血管事件随访。

1.6 研究方法

1.6.1 病例选择 对符合入选标准的病人，在病例报告表(case report form，CRF)上详细记录病人临床信息，包括病人一般资料、既往史、个人史、症状、体征、舌象、脉象、理化指标等。舌象由专人采用佳能IXUS 860数码相机统一拍照存档。同时留取血清于-80 ℃冻存，用于蛋白质组学检测。

1.6.2 随访 所有入选的CHD血瘀证病人均电话预约进行半年、1年面诊复查，记录临床信息，并抽血检查及留取血清冻存。对于未能进行面诊复查者，尽可能电话随访其急性心血管事件(acute cardiovascular events，ACEs)发生情况。对于随访期间因心血管病住院者，查阅其住院病历，对是否属于心血管事件进行确认。ACEs的定义：①心源性死亡；②非致命性心肌梗死；③缺血性脑卒中；④因不稳定型心绞痛需行血运重建术；⑤因不稳定型心绞痛住院。

1.6.3 病例分组 入选CHD稳定期病人1 503例，其中，血瘀证病人1 269例。对1 269例CHD血瘀证病人进行1年随访后，共有57例病人发生ACEs，其中，随访发生ACEs且入组时血样保存完好的23例病人为事件组(A组，作为“潜毒”组)；参照事件组病人，以性别、年龄(±5岁)、高血压、糖尿病、心肌梗死病史为匹配因素，按1∶1比例匹配未发生ACEs的23例病人为对照组(B组)；随访半年以后发生ACEs且血样保存完好的13例病人为复查组(C组)；AMI病人为D组(作为“毒证”组)。

1.7 血清多肽谱实验方法 根据CRF详细记录各组一般资料、既往史、个人史、症状、体征、辨证分型等。信息采集、录入人员均为心血管科专科医师并接受过统一培训考核，所有录入信息由课题组主要研究人员进行核查确认后，方为有效。数据录入采用双人录入，确保资料的准确可靠。中医的辨证分型由两名副主任医师以上中西医结合心血管医师确认。同时留取空腹血清于-80 ℃冻存，用于最后统一的蛋白质组学检测。

采用Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of Flight Mass Spectroscopy(Maldi-Tof-MS)方法对各组差异蛋白进行比较分析和鉴定，最终确定CHD“因瘀致毒”的特异表达蛋白。采用ClinProTool 2.1软件进行图谱分析和统计学处理，采用Bioworks Browser 3.3.1 SP1进行SequestTM检索，检索数据库为 International Protein Index(IPI human v3.45 fasta with 71983 entries)。

1.8 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。假设检验使用双侧检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。定量资料采用t检验、配对t检验、秩和检验、配对秩和检验、F检验、Kruskal-WallisH非参数检验；定性资料采用χ2检验、Fisher精确检验。

2 结 果

2.1 一般资料 在入选的1 269例CHD血瘀证病人中，根据随访ACEs和血样保存情况，共有23例事件组病人(A组)、23例对照组病人(B组)、13例复查组病人(C组)和15例AMI病人(D组)血清用于差异蛋白分析，13例复查组病人入组时的血样(C0组)亦用于差异蛋白分析。4组在性别、年龄、高血压、高脂血症、糖尿病、脑卒中病史、吸烟史、体质指数(BMI)及腰围等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，组间资料基本均衡。

2.2 蛋白组学分析 在所有入组病人中，“B-A-D”代表了由“无事件-潜毒-毒证”发生发展的过程，而“B-A”代表了“无事件-潜毒”的发展过程，且“B-A”的差异蛋白可能提示1年内是否发生ACEs。因此，本研究以“B-A-D”“B-A”的差异蛋白分析为主线，结合“A-D”“C0-C”的差异蛋白特点，寻找更适合反映“因毒致变”的蛋白质。筛选出的瘀毒相关差异蛋白多肽谱分析结果见表1，这些多肽在“A-B-D”“B-A”中差异均显著且趋势相同。分子量为1 945.31 Da的多肽在各组中差异最明显、趋势相同；分子量为1 981.25 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da的多肽在“B-A-D”“B-A”“A-D”中趋势一致；但分子量为6 631.28 Da、9 527.44 Da的多肽在“C0-C”的比较中趋势相反且差异有统计学意义；分子量为1 071.55 Da的多肽在“B-A-D”“B-A”中差异有统计学意义，且趋势相同，但在“A-D”“C0-C”中未发现该峰。综合以上结果，考虑分子量为1 945.31 Da、1 981.25 Da、1 071.55 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da可作为1年内“因瘀致毒”的蛋白指标。

表1 “瘀毒”相关蛋白的多肽谱分析结果

2.3 建立稳定期CHD病人“潜毒”及预测ACEs发生的模型 “B-A”两个状态转变是本研究最为重视也是病机转变的关键。把A和B两组的数据导出，对齐后找到利用1 945.31 Da、1 981.25 Da、1071.55 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da和9 527 Da建立模型(模型1)，采用K最近邻(k-Nearest Neighbor，KNN)算法，最终计算得到模型的识别率，即ClassFA：0.865，ClassFB：0.836，均值：0.850 5；交叉验证，进行了50次5折交叉确认预测率，即ClassFA：0.802，ClassFB：0.823，均值：0.812 5。

上述模型蛋白多肽数量较多，为进一步筛选关键蛋白，根据实验结果和既往文献[12-14]，利用1 945.31 Da、1 979.64 Da两个蛋白多肽建立模型(模型2)。最终计算得到模型的识别率，即ClassA：0.902，ClassB：0.786，均值：0.844 0；交叉验证，进行了50次5折交叉确认预测率，即ClassA：0.896，ClassB：0.764，均值：0.830 0。

2.4 “瘀毒”相关血清蛋白多肽的鉴定 根据以上方法及数据分析结果，本研究最终鉴定蛋白见表2。

表2 “瘀毒”相关蛋白多肽鉴定

3 讨 论

本研究表明，模型2较模型1对A组的确认预测率更高；对B组的确认预测率虽不及模型1，但仍较高。因此，同种型高分子量激肽原1的前体 (isoform HMW of kininogen-1 precursor，KNG1)和过氧化物还原酶-1(peroxiredoxin-1，PRDX1)可考虑作为CHD血瘀证“因瘀致毒”的分子标志物。

3.1 KNG1 本研究中，KNG1在CHD血瘀证病人“对照-潜毒-毒证”变化过程中逐渐增高，在发生事件病人入组至半年随访时的过程中亦逐渐升高，且在“毒证”病人中高表达最明显，表明KNG1增高可能是CHD“因瘀致毒”的特有指标，是CHD稳定期病人再发ACEs新的分子标志物。KNG1在细胞内经过加工、翻译形成高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HK)，而HK是激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kininsystem，KKS)的重要组成部分[15]，HK对心血管系统的作用有：①促凝作用。HK是一种凝血因子，在KKS的激活、裂解过程中，产生了促凝血和促纤溶两种作用，从而保持在生理状态下的平衡。有实验证明，在AMI大鼠中，HK升高，从而参与内源性凝血过程[16]。血HK浓度升高可能是下肢深静脉血栓的独立危险因素[17]，能明显增加骨外科术后下肢深静脉血栓形成的风险[18]。②致炎作用。激肽调节通过B1和B2两个受体发挥作用。已有证据证实，B2受体在心肌疾病中发挥抗纤维化、抗凋亡、抗炎的作用，而B1受体则促进炎性因子产生，刺激免疫细胞的迁移[19]。而在AMI病人中B1受体负向作用占优势，免疫系统的强烈反应会促进炎症发展并扩大梗死面积[20]。有实验发现，HKα通过激活PKC等多种途径与BK结合发挥致炎作用；HKα也可促进白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等细胞因子和趋化因子释放，加剧炎症反应。Dones等[21]研究表明，在急性冠脉综合征后4 d、2个月、6个月直至稳定的随访过程中，KNG1表达在稳定期出现下调趋势，与本研究结果相似，提示KNG1增高可作为CHD稳定期病人发生ACEs的一种生物标志物。但Parikh等[22]研究纳入了4 195例成年动脉粥样硬化病人，并进行了18年随访，并未找出KNG与CHD、脑卒中和心力衰竭的线性关系，提示KNG1可能是短期ACEs发生的特异性指标。Liu等[23]研究证实，KNG1是心阴虚证候的特异性分子标志物，但在病证结合中医病机转变方面仍需要进一步探索。

本研究在“无事件-潜毒-毒证”比较中，KNG1逐渐增高，且在“毒证”病人中增高更为明显，可能与“潜毒”和“毒证”病人中存在相对高凝状态和炎症反应有关，即“毒证”病人体内内源性凝血途径和炎症反应被过度激活。在稳定期CHD病人血清中KNG1表达较低，提示该蛋白在稳定期CHD病人中低表达，仅在ACEs风险增大时才会升高。

3.2 PRDX1 本研究中PRDX1在CHD血瘀证病人“无事件-潜毒-毒证”发展过程中亦逐渐升高，提示与“潜毒”的发展相关。通过EMBL-EBI中Uniprot查找该蛋白功能，主要参与细胞内氧化还原反应。PRXs是一类过氧化物酶家族，可分为6种亚型(PRXsⅠ-Ⅵ)、3个亚类，PRDX1是其中1种亚类。PRDX1位于细胞质，在肝脏、肾脏和胚胎中高表达。CHD的发生、发展过程中有氧化应激反应的参与。过多的氧自由基可引发脂质过氧化形成大量脂质过氧化物蓄积，损伤血管壁内皮细胞，加速动脉粥样硬化形成，最终导致心肌梗死和脑卒中；氧自由基可损伤心肌细胞膜、细胞内线粒体膜DNA、蛋白质，导致细胞凋亡；氧自由基还可导致钾、钠、钙等电解质紊乱，影响心肌细胞膜电位，使心肌细胞自律性加强，引发各种心律失常[24]。也有研究认为，氧化应激可以增加炎性因子的释放，加剧炎症反应，进而促使动脉粥样硬化斑块破裂[25]。

PRDX1在氧化应激条件下表达显著增高，具有去除过氧化氢、脂质过氧化物等作用，是机体的防御保障，是维持氧化应激状态下氧化还原平衡的重要细胞因子[26]。PRDX1有强大的抗氧化应激作用，并且可以充当分子伴侣的角色，在心血管系统中起保护作用。Guo等[27]研究表明，PRDX1水平在心肌梗死再灌注损伤大鼠中明显升高，其能够抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径引起的心肌细胞凋亡。PRDX1还能够抑制过强的血管内皮反应和早期的动脉硬化[28]。Jeong等[29]研究表明，PRDX1能够调节脂质内流，并维持氧化应激下巨噬细胞胆固醇稳态，从而发挥抗动脉硬化和改善细胞自噬相关疾病的作用。本研究中，“无事件-潜毒-毒证”过程PRDX1表达逐渐升高，说明该蛋白可以作为稳定期CHD病人发生ACEs的生物标志物。

4 小 结

本研究初步筛选到了CHD稳定期病人“瘀毒”病机转变的分子标志物——KNG1和PRDX1，构建了基于“瘀毒致变”理论识别CHD稳定期高危病人的模型，对于早期识别CHD稳定期高危病人、提高CHD的预防水平具有重要的意义，但还有待进一步的验证和完善。