口腔鳞状细胞癌中miRNA调控机制的研究进展

任晓彦，谢慧静，南欣荣

(1.山西医科大学口腔医学院，太原 030001； 2.山西医科大学口腔医院口腔颌面外科，太原 030001；3.山西医科大学第一医院口腔科，太原 030001)

鳞状细胞癌是一种上皮恶性肿瘤，具有解剖位置众多、转移能力显著的特点，鳞状细胞癌占头颈部恶性肿瘤的90%(每年超过60万新发病例)[1-2]。而口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部鳞状细胞癌最常见的类型[3-4]。OSCC居常见恶性肿瘤病理类型的第8位[5]。手术联合放化疗治疗口腔恶性肿瘤患者的长期生存率未见明显改善。OSCC的病死率与肿瘤的增殖、侵袭和转移息息相关，探索OSCC细胞的增殖、侵袭和转移机制、抑制癌细胞的增殖与转移，对临床诊断和治疗 OSCC具有重大意义。近年来，对基因的转录及翻译水平的研究发现，微RNA(microRNA，miRNA)参与了OSCC的增殖、侵袭和转移过程，而miRNA在OSCC中的相关靶向作用机制已成为目前的研究热点，但由于miRNA数量庞大、调控机制复杂多样，目前研究主要集中于单独miRNA对OSCC的影响。现就miRNA在细胞水平对下游各类细胞的靶向调控以及miRNA在生物发生或功能途径中的异常表达对肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)、肿瘤细胞、免疫细胞、血管生成细胞、上皮细胞以及癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)的影响予以综述，以期为深入理解miRNA调控肿瘤增殖、侵袭和转移的机制研究提供参考，并为肿瘤的早期诊断、早期治疗和疗效预测提供理论依据。

1 miRNA概述

miRNA是一组起源于基因组中非编码蛋白质基因的转录产物的非编码单链RNA分子，长度为20～24个核苷酸，其在转录后水平调控基因表达、控制细胞蛋白质的表达中起关键作用[6-7]。在细胞核中，编码miRNA的基因经过RNA聚合酶Ⅱ转录合成初级miRNA，之后经过Drosha酶剪切5′端的7-甲基鸟嘌呤核苷帽子结构和1个3′多聚核苷酸尾，切后形成发夹样前体miRNA，长度为70～100 nt。再经过输出蛋白5(一种位于细胞核中miRNA运输蛋白)和GTP酶结合将前体miRNA从细胞核运输至细胞质中。然后，前体miRNA被RNA内切酶Ⅲ Dicer和双链RNA蛋白复合物剪切后，成为含有21～25个核苷酸的成熟双链miRNA分子[8]。在分子水平上，受miRNA调控的蛋白质与miRNA的降解和翻译有关，成熟的miRNA通过结合靶基因的3′非编码区降解靶基因或抑制靶基因翻译，使一些基因表达异常，进而导致细胞信号转导过程紊乱，产生炎症反应、应激反应、分化、凋亡等生物学过程[9]。在此基础上，miRNA对各类细胞的生物学过程进行了精准的调控，使这些细胞发挥相应的功能，从而促进或抑制癌症的增殖、侵袭和转移。

2 miRNA对OSCC的调控机制

CSCs和肿瘤细胞的增殖、免疫逃避发生、肿瘤血管形成、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及CAFs的功能失调在肿瘤的发生发展中起重要作用。在OSCC中，miRNA主要通过对CSCs、肿瘤细胞、免疫细胞、血管生成细胞、上皮细胞以及CAFs等的调控来影响OSCC的增殖、侵袭和转移。

2.1通过调控CSCs的功能影响OSCC 干细胞是具有自我更新和增殖能力的细胞。OSCC中包含的一小部分细胞亚群被称为CSCs，其具有相似的特性，可导致肿瘤生长、转移和治疗后再增殖[10]。有证据表明，miRNA能够通过调节干细胞因子的表达影响信号通路，在CSCs增殖、侵袭和转移中发挥至关重要的作用[11]。Yu等[12]研究表明，miR-204可以直接结合转录因子性别决定区Y框蛋白(SRY-related high mobility group box，SOX)4的3′非编码区，并抑制转录因子SOX4的表达，从而抑制OSCC-CSCs的迁移/侵袭能力，降低集落形成能力和乙醛脱氢酶1阳性细胞的百分比。Lo等[13]研究发现，与头颈部鳞状细胞其他亚群相比，乙醛脱氢酶1及CD44表达阳性的头颈部鳞状细胞中miR-200c的表达水平显著下调，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点1升高，表明miR-200c能够通过靶向负性调节B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点1显著抑制乙醛脱氢酶1及CD44表达阳性细胞的恶性CSCs样特性。Patel和Rawal[14]研究表明，miR-5423p和miR-34a通过靶向CD44v6-Nanog-人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因轴来调控CSCs特性。此外，miRNA还可通过调控某些信号通路影响CSCs。miR-495通过下调同源框C6的表达抑制转化生长因子-β信号通路的激活，阻止CSCs进入细胞周期和促进细胞凋亡[15]。上调的miR-134通过抑制层粘连蛋白亚基γ2的表达，使磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路失活，从而阻断OSCC中CSCs进入细胞周期，抑制CSCs的迁移和侵袭[16]。CSCs在肿瘤的起始和进展中发挥关键作用，可通过早期靶向miRNA抑制CSCs的生物学作用，早期预防OSCC。

2.2通过调控肿瘤细胞的功能影响OSCC miRNA主要通过调控细胞周期的相关蛋白影响肿瘤细胞，如细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)、转录因子E2F1，细胞周期蛋白(cyclin)D1等。CDK是调控细胞周期的关键因子，CDK6是CDK家族的重要成员之一，其异常表达可促进癌症的发生发展[17-18]。miR-107可靶向作用于CDK6；上调或下调miR-107的表达量均可以显著影响CDK6水平，从而影响OSCC细胞的增殖、迁移[19]。在人类OSCC细胞系中，miR-504可通过靶向CDK6抑制细胞增殖、迁移和侵袭，在OSCC中发挥抑癌作用[20]。此外，OSCC细胞中miR-504的过表达可以显著抑制细胞周期相关蛋白E2F1、cyclin D1的表达，明显增加CDK抑制剂p21的表达，从而影响细胞周期的进程。He等[21]检测细胞周期相关基因发现，转染miR-24-3p模拟物组OSCC细胞中cyclin B1、cyclin D1、cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6的表达水平均显著高于未转染miR-24-3p模拟物对照组，且均能促进细胞增殖，而p21和p27的蛋白表达水平显著低于该对照组。此外，Period 1被认为与OSCC的增殖和细胞周期进程有关[22-23]，而miR-24-3p可通过靶向抑制Period 1维持OSCC细胞的增殖。以上研究均提示,miRNA能够对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移产生抑制性作用，可作为治疗及评价OSCC预后的生物学标志物。

2.3通过调控免疫细胞的功能影响OSCC miRNA在调控免疫细胞活化和免疫应答方面起重要作用[24]。肿瘤细胞可以通过不同方法逃避CD8+T淋巴细胞或自然杀伤细胞的免疫监视，该机制可能通过miRNA直接促进或抑制免疫细胞中免疫调节分子的表达实现，也可能通过癌细胞源性外泌体中的miRNA调控免疫细胞实现。Yu等[25]研究表明，let-7家族miRNA通过靶向T细胞因子4激活β联蛋白/N-糖基转移酶STT3通路促进免疫抑制蛋白程序性细胞死亡配体1降解，从而抑制头颈部鳞状细胞癌的免疫逃避。陈万涛等[26]研究表明，OSCC细胞源性外泌体中携带的miRNA被自然杀伤细胞内化后可以调控自然杀伤细胞免疫功能，从而影响癌瘤周围环境中淋巴细胞的作用，继而影响OSCC细胞的增殖、迁移。Cai等[27]发现，OSCC细胞源性外泌体中含有miR-29a-3p，miR-29a-3p可通过激活巨噬细胞内的SOCS1/信号转导及转录激活因子6信号，从而介导M2型巨噬细胞极化，促进OSCC系细胞(SCC-9和CAL-27)的增殖和侵袭。另外，Momen-Herav和Bala[28]在来自CAL-27细胞的细胞外小泡中发现，miR-21通过诱导单核细胞产生大量促进肿瘤进展的衍生物单核细胞趋化蛋白-1，从而调节免疫功能，建立肿瘤微环境。因此，通过miRNA恢复功能失调免疫细胞的原有功能，有望为OSCC的治疗提供新途径。

2.4通过调控上皮细胞的功能影响OSCC EMT是上皮细胞获得间充质细胞特征并在肿瘤细胞中发挥侵袭和转移作用的过程，故被认为在肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中起重要作用[29]，而miRNA可通过正调控或负调控上皮细胞的间充质转化介导肿瘤的发生发展及侵袭转移[30]。

2.4.1负调控OSCC中的EMT 众多miRNA可通过不同方式对EMT产生负调控作用，其可能成为OSCC的抑癌因子和潜在治疗靶点，可抑制EMT相关转录因子、蛋白并阻断EMT相关信号通路。miR-205和miR-200c可显著抑制EMT相关转录因子锌指E盒同源蛋白1、锌指E盒同源蛋白2的表达，从而抑制肿瘤细胞的EMT[31-32]。Wei等[33]研究表明，EMT相关转录因子SOX4可被miR-199a-5p负向调控，进而抑制OSCC的迁移和侵袭。有研究发现，miR-106a靶向减少LIM激酶1的表达以及miR-488直接下调转录激活因子3的表达均可抑制OSCC细胞的侵袭和EMT，阻断EMT相关信号通路[34-35]。miR-27a-3p通过靶向Yes关联蛋白1，阻断Yes关联蛋白1-八聚体结合转录因子4-SOX2信号轴，miR-495通过下调同源框C6抑制转化生长因子-β信号通路的激活，进而抑制OSCC细胞的EMT过程[36]。此外，miR-204-5p、miR-15b、miR-137还可通过抑制各自的特定靶点抑制OSCC的EMT[37-39]。

2.4.2正调控OSCC中的EMT 有些miRNA可通过靶向调控基因和相关蛋白促进的EMT发生。Li等[40]研究发现，miR-19a和miR-424通过靶向下调转化生长因子受体Ⅲ的表达诱导EMT。另有研究显示，miR-639通过靶向叉头框蛋白C1调控转化生长因子-β诱导EMT[41]。Wu等[42]研究发现，miR-155-5p通过靶向抑制染色质重塑基因AT富集作用域2，促进OSCC进展，增强OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，在调节OSCC的EMT中起决定性作用。Kim等[43]研究发现，miR-200通过直接靶向抑制RNA结合震动蛋白的表达诱导OSCC发生EMT；miR-29b-1-5p通过靶向下调钙黏蛋白1的表达诱导OSCC细胞EMT[44]。Qiao等[45]研究发现，miR-27a-3p通过下调分泌型皱褶相关蛋白1调节Wnt/β联蛋白信号通路，进而促进OSCC的EMT。总之，EMT对OSCC的作用至关重要，众多miRNA之间的协同作用或拮抗作用形成庞大的调控系统，上皮细胞能否作为miRNA调控OSCC的终点还有待进一步研究。

2.5通过调控血管生成细胞的功能影响OSCC 肿瘤血管生成可调节肿瘤生长和转移，在肿瘤进展中起重要作用。miRNA通过调控肿瘤中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞等的表达影响肿瘤的血管生成，从而影响肿瘤进展。miR-29b通过功能性靶向蛋白激酶3和抑制血管内皮生长因子的表达抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成[46]，而miR-378a-5p、miR-126、miR-320在OSCC中具有相似功能。

沉默激肽释放酶4可以抑制OSCC细胞增殖以及集落形成，诱导OSCC细胞凋亡[47]。Cui等[48]发现，miR-378a-5p下调促进了血管内皮生长因子的表达，而激肽释放酶4的过度表达促进了OSCC细胞的血管生成，增加了血管内皮生长因子的表达。他们用双荧光素酶实验证实了miR-378a-5p通过靶向激肽释放酶4的3′非翻译区对激肽释放酶4产生负调控作用，进而抑制OSCC的血管生成。miRNA-126是血管内皮生长因子A的负调控因子，Sasahira等[49]的体外实验显示，miR-126低表达激活了与肿瘤进展相关的血管生成和淋巴管生成。Yang等[50]研究表明，miR-126的过度表达显著减少了OSCC-15细胞中血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的分泌，而抑制miR-126可明显促进其分泌，提示miR-126可能具有抑制血管生成的功能，至少可部分通过抑制表皮生长因子样结构域7表达实现。Wu等[51]研究发现，miR-320是一种抗血管生成因子，在OSCC肿瘤组织和血管中表达下调。miR-320可能通过靶向并抑制神经菌毛素-1的表达抑制内皮细胞的迁移，并作为抗血管生成因子在抑制肿瘤血管生成中发挥重要作用。上述miRNA的发现不仅证实了血管生成细胞在OSCC中的作用机制，还为OSCC的靶向治疗提供了新的依据。

2.6通过调控CAFs的功能影响OSCC CAFs是肿瘤实体中最丰富的细胞成分之一，在胃癌[52]、肺癌[53]和OSCC[54]的发生发展过程中起至关重要的作用。OSCC细胞中miRNA的失调被认为与癌症的生长和进展有关[17-23]；但CAFs中miRNA的失调和功能紊乱尚不明确。在许多类型的实体瘤中，CAFs中miRNA的失调被认为是肿瘤增殖、侵袭和转移的重要因素[55]。Min等[56]通过体外共培养实验发现，CAFs中miR-148a的下调促进了人OSCC-25细胞的迁移和侵袭，表明miR-148a在CAFs中的上调可以通过靶向Wnt10b介导的信号通路抑制OSCC的迁移和侵袭。另有研究表明，CAFs可以通过外显体与肿瘤细胞“沟通”[57]。Sun等[58]研究发现，CAFs衍生的外显体将miR-382-5p转运到OSCC细胞，并参与OSCC细胞的迁移和侵袭。Li等[59]发现，当CAFs来源外泌体中miR-34a-5p显著下调后，CAFs可将miR-34a-5p缺失的外泌体转移到OSCC细胞中，负向调控miR-34a-5p对受体酪氨酸激酶的靶向作用，从而介导OSCC细胞的增殖和恶性进展。因此，切断CAFs外显体与肿瘤细胞的联系能够抑制OSCC细胞的增殖，这可能是针对CAFs的靶向抗癌的一种新方案。

3 小 结

miRNA调控肿瘤的方式多种多样，且各种过程可能互相影响，因此明确miRNA调控肿瘤的具体调控机制及其作用网络十分必要。目前，相关研究面临的主要难题包括：①同一miRNA常在多种肿瘤中异常表达，很少呈现组织特异性表达；②多种miRNA与靶基因之间的关系尚未完全明确；③miRNA的研究进展在很大程度上受实验方法和检测仪器的限制；④如何更安全、有效地通过靶向抑制或诱导内源性miRNA治疗肿瘤。未来，可以利用分子生物学、蛋白质组学及动物实验等方法深入研究肿瘤发生、发展过程中的特定miRNA，以寻找肿瘤治疗的有效靶点。