口蹄疫疫苗的研究进展

孙 莹 孙晓军 包世俊*

1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070；2.甘肃省兰州市动物疫病预防控制中心，兰州730050

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，俗称“口疮”。该病易感动物为家养或野生偶蹄动物，多达70 种。发病动物主要临床表现为唇内面、齿龈、舌面、脸颊部黏膜、四肢下端及乳房处等无毛部位形成水疱，水疱破溃后形成红色溃烂，严重病例蹄壳脱落，引发动物跛行。成年发病动物，生产性能降低，如种畜失去种用价值，奶畜产奶受到影响。幼龄动物感染后可导致出血性肠炎和心肌炎，常因心肌麻痹而猝死，病死率高达100%[1]。由于该病潜伏期短、发病率高（50%～100%）、传播迅速，一旦出现疫情，极易发生大范围的流行，给养殖业造成巨大的经济损失[2]。

FMDV 属于微RNA 病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），病毒粒子是由单股线状正链RNA和包围其外的衣壳蛋白两部分组成，是目前已知动物病毒中最小病毒之一[3]。口蹄疫同一血清型的毒株抗原性也存在差异，每个型可根据结构蛋白VP1 的核苷酸序列差异可分为拓扑型，进一步可将拓扑型分为不同谱系。FMDV 易发生变异，进一步增加了疫苗毒株筛选的难度，从而给FMD 的防控带来了严峻的挑战。随着生命科学领域不断取得新的突破，现代生物技术的发展亦突飞猛进，并在新型疫苗的研发中被广泛应用，从而为高效、安全、稳定的新型口蹄疫疫苗的研发提供了技术保障。

1 传统疫苗

1.1 弱毒疫苗

弱毒疫苗是由豚鼠，乳鼠，鸡胚，连续细胞传代或对口蹄疫原始株的人工诱变获得的人工减毒株和减毒株。大量扩增后，加入一定剂量的保护剂和佐剂。它是一种成本低廉，使用方法简单的病毒制[4]。1960－1980年，云南省澜沧江以西地区面对AsiaⅠ型口蹄疫采用中国保山型（ZB 型）致弱毒株进行免疫防治[5]。在3～5日龄乳兔体内传代109代，回归牛体毒力减弱，致病力和免疫原性均达到口蹄疫弱毒疫苗标准，免疫保护效果良好，且免疫持续期达半年以上。但是，由于新的毒株不断出现，毒株的致弱结果和致弱时间不能确定，在假定宿主中致弱的毒株，会对其他易感动物具有强致病性，甚至存在与流行毒株重组、毒力返祖和回复突变的潜在风险，以及活毒株持续感染、妨碍疫源净化等缺点，现兔化弱毒疫苗株ZBatt 已停用，逐渐被其他类型疫苗所取代[6]。

1.2 灭活疫苗

灭活疫苗主要包括口蹄疫O 型灭活苗及口蹄疫O 型、A 型二价灭活苗两大类。该类疫苗是通过悬浮培养传代细胞、病毒抗原浓缩纯化、灭活乳化等生产工艺进行生产。近年来，随着生产工艺的不断提高，灭活疫苗质量显著提升[7]。口蹄疫灭活疫苗生产需要高标准的生物安全设施和严格的操作规程，可能存在强毒灭活不彻底的风险和多次免疫接种动物后产生非结构蛋白抗体影响感染与免疫鉴别等。因此，研制能区分感染与免疫的标记疫苗、亚单位疫苗等新型基因工程疫苗是目前研究的热点[8-9]。目前，FMD 免疫接种主要使用口蹄疫灭活疫苗，其安全性高，免疫效果好，在FMD的防控中发挥了重要作用，A 型显著减少，O 型零星散发，社会效益显著。

2 生物技术疫苗

2.1 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是以病毒（痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒）或细菌作为载体，将外源基因插入载体基因组的非必需区内，通过转染细胞，随载体增殖，使得外源基因得到高效表达，再将表达产物纯化用于免疫[10]。同时，载体本身也会起到佐剂作用，刺激动物机体的细胞免疫。刘新生[11]构建乳酸杆菌载体口蹄疫VP1基因DNA 疫苗，使小鼠和猪体内均产生特异性细胞免疫和体液免疫。

2.2 基因工程亚单位疫苗

利用DNA 重组技术，将编码FMDV 的保护性抗原基因导入原核或真核细胞，以获得重组免疫保护蛋白作为抗原制成的疫苗，免疫动物后，动物体内会产生中和抗体，提高机体抵抗力。由于免疫原单一，也有效解决了传统疫苗免疫抑制的问题。FM⁃DV 基因工程亚单位疫苗主要利用各种表达系统包括大肠杆菌、枯草杆菌等表达系统表达VP1 蛋白，但该蛋白在原核表达系统中通常会出现无法正确加工和折叠等问题，通过用酵母、杆状病毒等表达系统表达VP1 蛋白制成疫苗，则提高了疫苗的免疫原性，有效克服以上不足。基因工程亚单位疫苗安全价廉，便于大规模生产，目前应用较多。

2.3 基因缺失/标记疫苗

基因缺失疫苗是利用基因工程技术去除与病原体毒力有关的基因，获得毒力丧失或降低的毒株，但不影响免疫原性，又称标记疫苗，免疫效果好，安全、遗传性能更稳定，毒力不返祖[12]。缺失的基因还可作为一种遗传标志，用于建立鉴别诊断方法，有研究证实含缺失3A 蛋白aa109～aa115 位（B细胞表位）编码区的FMDV 是可用于鉴别诊断的FMD标记疫苗[13]。

2.4 合成肽疫苗

FMDV的主要保护多肽是通过化学合成或基因工程人工合成的，并连接到大分子载体上，可以根据流行株的情况调整用适当佐剂制成的疫苗。由于合成肽疫苗的免疫效力不如常规灭活疫苗，目前，合成肽疫苗在猪口蹄疫的预防与防控中较常用。

2.5 基因疫苗

包括DNA 疫苗、RNA 疫苗，是指由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成，将其直接导入动物体内，通过宿主细胞转录表达系统合成目标抗原蛋白，诱导宿主对该抗原蛋白产生免疫应答，达到预防和治疗疫病的目的。基因疫苗具有较强的热稳定性，因而便于贮存和运输。

2.6 反向遗传疫苗

如今，由于反向遗传技术不断发展，使得通过对FMDV 的靶基因进行改造和修饰，如替换、突变、插入或敲除FMDV 部分基因等方法制成的疫苗，免疫动物同样能达到较好的免疫效果。FMDV反向遗传疫苗的研制为开发新型疫苗开辟了新方向，表位互补叠加，拓宽了抗原谱，组合优势毒株，免疫效力大大提高，免疫保护期延长，提高了生物安全性，在疫苗研发方面取得了突破。

2.7 转基因植物可饲疫苗

随着转基因技术的不断发展，FMDV 可饲疫苗的研究也取得了重大突破。可饲疫苗是通过把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，将抗原基因导入植物细胞中，形成转基因植物，利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白作为疫苗，或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫，是当前新型疫苗研究的热点之一。除此之外，可饲疫苗还常以苜蓿、番茄、马铃薯等为表达体系，使用安全性高，成本较低，免疫方法简便，为生产动物疫苗提供新思路，但由于动物个体的摄入量不同，免疫效果不易保障，仍需进行深入研究。

2.8 表位疫苗

表位疫苗是通过基因工程技术人工合成病原微生物的抗原表位，与T 细胞表面受体（TCR）、B 细胞表面受体（BCR）或抗体分子特异性结合，引起特异性免疫应答，诱导动物机体产生体液及细胞免疫应答[14]。利用不同血清型的抗原表位的组合，制备多价疫苗，对不同血清型的FMDV 侵袭形成保护。由于多表位疫苗具有广谱表位信息，可避免由于病毒变异导致免疫失败。现阶段，病毒样颗粒、蛋白分子、脂质分子均是理想的表位疫苗载体，乙型肝炎核心病毒抗原（HBcAg）是目前最具潜力的表位疫苗病毒样粒子载体[15]。HBcAg 有3 个区域：N 端、C 端、MIR 区均可插入外源基因。通过在MIR 区第75～78 位氨基酸、75～80 位氨基酸和75～82 位氨基酸插入FMDV 的多表位的不同组合，构成病毒样粒子，在体内外均能被吞噬细胞吞噬，并能提高特异性抗体表达水平，显著提高淋巴细胞的增殖能力。由此可见，表位疫苗具有广阔研究前景。

3 结 语

自口蹄疫疫苗问世70余年来，免疫接种仍旧是世界上许多国家和地区预防控制口蹄疫的主要途径。本综述了国内外口蹄疫疫苗的研究情况，为未来探索研究口蹄疫新型疫苗提供参考。