中国宫颈癌DNA甲基化标志物的研究进展

赵敬，杨金豪综述，常艳敏，王蓉审校

（1.天津医科大学总医院妇产科，天津 300052；天津医科大学医学检验学院，天津 300203；天津市南开医院检验科，天津 300100）

我国每年宫颈癌新发病例数为13.3万以上，其中约有2万～3万死亡病例，且近年来我国年轻妇女宫颈癌的发病率、死亡率均呈上升趋势[1]。目前研究证实宫颈癌的发生、发展与DNA甲基化相关[2]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为底物，将其提供的甲基基团加在胞嘧啶的第5位碳原子上，发生甲基化修饰，基于GC配对的机制，mCpG会在双链中对称出现。DNA甲基化对于基因的表达有重要的调节作用[3]。某些抑癌基因的启动子区域发生甲基化，可降低其转录活性，使抑癌基因表达沉默，导致细胞增殖异常而产生恶性肿瘤。随着对甲基化认识的不断深入，研究者发现基因启动子区异常甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，是肿瘤早期诊断的非常有效的分子标志。此外，在肿瘤的发展过程中，DNA甲基化的动态改变还可以反映肿瘤的严重程度分级、侵袭转移及提示患者的预后。然而，由于种族，生存环境的不同，各国报道的宫颈癌DNA甲基化标志物差异显著。因此，本文对在中国妇女群体进行实验验证的宫颈癌DNA甲基化标志物做一总结分析，以期对后续的研究有所帮助。

1 宫颈癌高甲基化标志物

细胞信号转导通路的异常往往影响细胞增殖和分化的正常调控，导致肿瘤的发生。因此可以把信号途径相关的甲基化基因作为宫颈癌治疗的重要靶点，通过对细胞信号途径的干预，调整靶基因表达，使其恢复正常，以达到抑制肿瘤生长，治疗肿瘤的目的。从我国近几年报道的宫颈癌甲基化基因的生物学功能来看，主要集中在p53通路、凋亡相关、DNA修复、Ras信号通路、细胞循环(细胞周期)、细胞黏附、转移和侵袭、Wnt通路等与癌症发生、发展相关的信号通路。

1.1 DNA修复DNA修复是细胞对其DNA受损伤后的一种反应。MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)是一种高效的DNA直接修复酶，能修复DNA序列中的6氧甲基鸟嘌呤的损伤，是人类细胞中迄今发现的唯一一种修复该损伤的甲基转移酶。简生燕等[4]研究显示，宫颈癌组织MGMT甲基化率可达71.15%；且与组织分化程度呈负相关，并影响其基因的mRNA的表达。

1.2 细胞周期p16（INK4A）是周期依赖性激酶抑制因子，人类许多肿瘤存在p16基因和蛋白的改变。在宫颈癌组织中p16甲基化率（26%）显著高于癌旁正常组织，且随病变程度加重呈现升高趋势。此外，p16基因启动子甲基化与宫颈癌的临床病理特征有关联，甲基化更多发生在年龄小于40岁、低分化的宫颈鳞癌患者；p16甲基化的发生是独立于HPV感染的事件，它们在宫颈癌的致病过程中有可能是选择性的作用于不同的时期。

FHIT基因属于组氨酸家族，吴庆华[5]首次在宫颈癌组织中揭示了FHIT基因5′端CpG岛甲基化及其与基因失活的相关性。同期，史惠蓉等[6]又对宫颈癌及正常宫颈组织标本进行了检测,结果宫颈癌标本中40%出现FHIT基因甲基化而正常宫颈上皮标本中未发现。任力群等[7]亦发现FHIT甲基化在宫颈癌组织（56.7%）中显著高于宫颈上皮内瘤样变（CIN）组（14.3%）及慢性宫颈炎组（0）。鉴于FHIT甲基化在肿瘤组织的显著性，研究者们期待将其转化为临床可应用的肿瘤标志物，对临床获取血清样本的检测发现，血浆FHIT甲基化的发生率与组织具有良好的相关性[8-9]。

SEPT9基因是GTP结合蛋白家族成员，参与细胞骨架的形成、细胞分裂和肿瘤的发生等。其基因启动子的高甲基化已经做为大肠癌的标志物，最近研究显示其亦可促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移，影响细胞周期的调控。其基因的甲基化对宫颈癌的诊断也具有良好的敏感性和特异性（AUC=0.854，P<0.001）[10]。

1.3 细胞凋亡 相关蛋白激酶1（DAPK1）是细胞凋亡正调控因子，是一种抑癌基因。我国Yang等[11]发现在60%宫颈癌组织、40%宫颈癌患者血浆中DAPK1启动子区存在异常甲基化。而且还发现DAPK1基因启动子区甲基化的程度与临床病理学分级相关，且对于鳞癌细胞的检出更敏感[12]。花敏慧[13]也得出了DAPK1甲基化在筛查宫颈癌和癌前病变的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为46.43%、97.92%、96.30%和61.04%。

1.4 细胞黏附、转移和侵袭CDH1基因编码E-钙黏蛋白，属于细胞黏附分子家族，介导相邻的上皮细胞间依赖钙的细胞连接，对于维持细胞分化、极性和正常组织结构起重要作用。Chen等[14]发现在75%的宫颈癌组织中CDH1蛋白表达缺失，且40%的宫颈癌组织中呈现高甲基化，此外，CDH1基因高甲基化与DNMT1的增加相关。Ren等[15]研究了宫颈癌血清样本与组织标本一致率达76.66%。陈勇等[16]还发现CDH1基因甲基化率与临床病理特征相关。其甲基化率鳞癌组比腺癌组高，随肿块增大及FIGO分期升高而增高。

研究发现CADM1/TSLC1（细胞黏附分子1）在宫颈癌组织中异常甲基化率达66.2%，其中鳞癌67.8%，腺癌55.5%，宫颈上皮内瘤变组织43.3%。此外，hrHPV感染的CIN 2/3到宫颈癌的演进过程中经常发现由于启动子甲基化引起的CADM1基因表达沉默，但是CADM1/TSLC1 mRNA在非瘤性HPV永生化细胞株中表达丰富，提示CADM1/TSLC1基因表达沉默可能与HPV永生化到致瘤性表型的转化有关[17]。

EZRIN蛋白编码细胞质外周膜蛋白，主要是微绒毛的蛋白酪氨酸激酶底物作为ERM蛋白家族的一员，该蛋白主要在质膜和肌动蛋白细胞骨架之间起作用。其在细胞表面的黏附、迁移和组织中起着关键作用，并与多种人类癌症有关。

1.5 Ras信号通路 宫颈癌组织中RASSF1A基因的甲基化首先是在小细胞肺癌组织中被发现的，常处于失活状态。最近也有研究显示，RASSF1A基因在宫颈癌组织甲基化阳性率为35%，其甲基化率随着临床分期呈逐渐升高趋势。同时，宫颈鳞癌的RASSF1A基因甲基化率明显高于宫颈腺癌，但RASSF1A基因甲基化与宫颈癌的组织学分级和淋巴结转移无关[18]。

1.6 Wnt信号通路 正常的APC蛋白与Axin、Gsk-3β形成复合物可降解β-catenin，保证Wnt信号途径对细胞特化、增殖以及迁移的正常调节[19]。APC基因表达异常使游离β-catenin增多，引起基因不正常表达，将导致细胞黏附、生长、分化等方面的重要改变，使细胞发生癌变。宋银宏和张昌菊[20]研究发现APC启动子区CpG岛在Hela细胞中全甲基化，在Siha细胞中无甲基化。

SFRP1是Wnt信号通路的负调控因子，主要与FZ受体竞争结合Wnt蛋白，阻断Wnt信号的转导，调节细胞的增殖、凋亡。胡丹尼等[21]探讨了SFRP1基因启动子区甲基化与宫颈癌进展的相关性。结果显示，甲基化率大于80%的CpG多分布于CIN2/3和宫颈癌组织之中。Chung等[22]研究也证实SFRP1基因高甲基化与宫颈癌的进展相关。

1.7 转录因子SOX家族基因参与性别决定、骨组织发育、血细胞形成、神经系统发育及晶状体发育等多种组织器官的发育过程。目前，SOX1和SOX9甲基化与宫颈癌的关系在我国已有报道。张秀茹等[23]报道了宫颈癌组织中SOX1 CpG岛的甲基化率大于50%，且与正常对照差异有统计学意义。巫剑红等[24]则鉴定了SOX9基因的甲基化，发现宫颈癌组平均甲基化分值高于正常宫颈组，鳞癌高于腺癌，G3高于G1/G2，有淋巴结转移和脉管癌栓的高于无淋巴结转移和脉管癌栓的。

PAX1也是一种重要的转录因子，参与骨骼发育形成。Pax1的基因突变会导致严重的脊柱缺陷。分别采用MSP、QMSP和测序等多种方法对宫颈癌及宫颈癌前病变的PAX1甲基化率进行了检测和临床评价，结果显示Pax1基因甲基化率显著高于正常组织，且随着病变加重而增高，可应用于临床宫颈癌的筛查。

2 HPV基因组的DNA甲基化

DNA甲基化也可以调节HPV的基因表达。胡元晶[25]对HPV16 L1基因3′端和LCR基因进行了测序。结果位于E6/E7启动子的5个位点存在随病情进展甲基化水平逐渐降低的趋势，宫颈癌组患者的甲基化水平最低。位于L1基因3′端的3个位点的甲基化水平在携带组、CIN组与宫颈癌组患者间比较有差异。由此推断，HPV16甲基化状况可能预测宫颈癌癌前病变或宫颈癌的发生。

3 地区及种族特异性报道的甲基化基因

新疆是我国宫颈癌高发区之一，维吾尔族妇女宫颈癌患病率，病死率在全国少数民族中占第1位[26]。目前，报道过的和宫颈癌发生相关的甲基化基因包括DAPKTFPI-2CALCACADM1、SFRP1、P16、MDR1、CCNA1、APM、EGFR、hRFT2、IFITM1和HS3ST2等，与新疆维吾尔族妇女宫颈癌的发生、发展密切相关。玛依拉·卡米力江等[27]认为RAR基因高甲基化是维吾尔族宫颈癌演进过程中的重要标志。

此外，除了中国大陆，中国台湾地区关于宫颈癌甲基化标志物的研究也方兴未艾。其中，LAI等[28-29]研究发现宫颈癌DNA甲基化基因包括SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1等。近期研究显示LMX1A、NKX6-1、PAX1、PTPRR、SOX1和ZNF582也是宫颈腺癌中出现的高甲基化基因[30]。

4 宫颈癌低甲基化标志物

基因启动子区异常甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，是肿瘤早期诊断的非常有效的分子标志。然而，目前大多数研究集中在高甲基化基因，而低甲基化基因报道较少。有报道STK31基因在HPV16/18阳性宫颈癌细胞系中，其启动子/外显子1呈现低甲基化，从而诱导HPV16E7/E6的整合[31]。也有报道长链非编码RNA（lncRNA）SOX21-AS1低甲基化在宫颈癌中有着临床预后价值，lncRNA SOX21-AS1在宫颈癌中参与的生物过程如表皮发展、脱皮周期、皮肤表皮及分子功能等，lncRNA SOX21-AS1作为一种肿瘤抑制因子，是一种良好的宫颈癌预后指标[32]。

5 小结

DNA甲基化肿瘤标志物由于其样本来源广泛，检测方法简便稳定，并且可以实现高通量检测，易于临床转化等优点，而日益成为研究热点。每年，欧美国家都有一些宫颈癌相关的新的甲基化标志物不断涌现，如荷兰报道6个标志物的联合检测法(ASCL1、LHX8、ST6GALNAC5、GHSR、SST、ZIC1)[33]。同时，欧美国家在积极推进宫颈癌甲基化标志物的临床转化。目前，荷兰、德国已经推出了商业化的宫颈癌甲基化的检测试剂盒，包括PreCursor-M®，QIAsureMethylation Test®，GynTect，Oncgnostics®等[34]。相对于世界的研究水平，我国宫颈癌DNA甲基化的研究相对滞后很多，首先，缺少具有独立知识产权的、针对中国妇女群体的宫颈癌甲基化标志物；其次，目标分散，缺少系统的大样本群研究；再次，严重缺乏临床转化研究，缺乏在特殊人群如孕妇、人类免疫缺陷病毒感染患者群体的评价等，缺少对自检样本的检测结果的评价，缺少随访研究等。最后，DNA甲基化标志物要想真正进入临床，还需在方法学上进行改善优化，开发即时检验（POCT）产品；而持续深入研究这些甲基化基因的功能也是必不可少的；当然，深入调查启动子低甲基化的基因亦是未来的重要研究方向之一。