葡萄糖氧化酶的微生物发酵生产工艺研究

2021-12-05 15:05王佰涛杨文玲杨婧芳刘德海陈国参权淑静
中国饲料 2021年5期
关键词:层析葡萄糖菌株

王佰涛, 杨文玲, 杨婧芳, 刘德海, 陈国参, 权淑静,2

(1.河南省科学院生物研究所,河南郑州450008;2.河南省工业酶工程技术研究中心,河南郑州450008;3.安阳市动物卫生监督所,河南安阳455000)

葡萄糖氧化酶是分子质量为150 ~170 kDa的同源二聚体, 含有两个紧密相连但非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸辅助因子,能够将β-D 葡萄糖氧化为葡萄糖醛酸和过氧化氢 (Wu 等,2018)。 近年来,葡萄糖氧化酶与人类生活联系越来越紧密, 全球市场预测年增长率达到7.6%,市场价值将超过60 亿美元(Rasul 等,2011)。 葡萄糖氧化酶广泛应用于饲料业和食品业中, 可以改善动物饲料的消化利用率(Wang 等,2018)和食品的保鲜时间(Ge 等,2012)。 在生物电化学和临床上葡萄糖氧化酶也有一些应用。例如,可以将其电化学特性用于生物燃料电池和生物传感器方面的开发(Xu 等,2019);利用其可加速癌细胞内的葡萄糖代谢, 促进癌细胞的坏死和凋亡 (Fan 等,2017)。葡萄糖氧化酶的这些应用促进了其市场需求, 其生产工艺和酶学性质的改进也成了实际研究中的重点, 要求其能够在较高的温度条件和较长的保存时间下仍然保持催化活性。

葡萄糖氧化酶在自然界中的来源范围较广,包括动物、植物和微生物,动植物来源的葡萄糖氧化酶种类较多,但产出效率较低。 例如,棉铃虫体内的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶可以转化为葡萄糖氧化酶,而后由下唇腺分泌出昆虫体外,但分离过程复杂,应用价值较低(董人富等,2015)。微生物来源的葡萄糖氧化酶主要来自于真菌,并且产酶效率极高,其他来源的葡萄糖氧化酶,无论从产酶效率还是提取难易度都无法和微生物相比, 因此目前主要通过微生物发酵来生产葡萄糖氧化酶(王佰涛等,2019)。本文从葡萄糖氧化酶的发酵生产工艺、提取纯化工艺、酶学特性改进工艺等方面对其做了简单介绍。

1 葡萄糖氧化酶发酵生产工艺

葡萄糖氧化酶的微生物发酵生产工艺主要涉及到菌种选育、培养基优化、发酵条件优化等几个方面,最终目的主要是通过选育优势菌种、筛选最佳培养条件来提高产酶效率,降低生产成本,利于工业化生产和应用。

1.1 菌种选育 目前用于葡萄糖氧化酶生产的微生物主要是青霉和曲霉等丝状真菌, 这些霉菌在底物亲和力、 催化活性及热稳定性方面各有优势,不同生产条件下选用的菌种有所不同(Tu 等,2019)。 研究发现,霉菌在发酵过程中也存在某些不足,例如,霉菌菌丝体会增加发酵液黏度,进而影响发酵搅拌速率和供氧速率, 导致菌体营养不良,使得产品收率下降。酵母菌在液体深层发酵过程中能够保持较高的生物量, 而且从培养液中分离程序简单, 因此工业生产中也会选用酵母菌作为发酵菌种, 常常通过基因工程构建工程菌在酵母中进行异源表达,常用酵母菌有毕赤酵母、汉逊酵母、 酒 酿酵 母等 (Qiu 等,2016;Demain 等,2009)。最初筛选用于生产葡萄糖氧化酶的菌株应满足以下条件:首先,应用菌株的产酶量较高且生产性能稳定;其次,从生产成本上考虑,应用菌株应易于培养, 且得到粗酶分离纯化程序简单;最后,应保证应用菌株产酶的安全性,避免对人体健康造成不必要的风险。 曲霉和青霉能够作为生物产品在工业生产上取得成功, 很大程度上是由于这些菌株的代谢多功能性和其公认的安全性。 野生型菌株因发酵生产能力低下、 纯化过程复杂而受到制约, 因此需要通过人工诱变进行特异性筛选,进而得到一些性能优越的菌株以利于生产。真菌DNA 在各种外界条件的作用下会发生嘧啶突变,产生遗传变异。一般采取的诱变方法有伽马射线照射、紫外照射、化学诱变、原生质体融合等。例如,Khattab 等(2005)在多个黑曲霉突变体种内进行原生质体融合以获得高产葡萄糖氧化酶菌株,结果发现所有融合子活性均超出原菌株200%以上, 表现出比原菌株更高的葡萄糖氧化酶生产能力。 Haq 等(2014)利用乙基甲烷磺酸和亚硝酸对野生型菌株进行化学诱变以提高葡萄糖氧化酶产量, 获得优势菌株的产酶量达到野生菌株的3 倍以上。 说明通过菌种选育可以提高菌株产葡萄糖氧化酶的能力。

1.2 发酵条件优化 选育出优势菌株以后,采用不同的发酵条件, 葡萄糖氧化酶发酵产出效率不同,因此需要对微生物发酵条件进行优化。 Singh等(2013)发现,利用黑曲霉生产葡萄糖氧化酶时,培养基中的Mg2+、Ag+、Cu2+等金属离子会表现出明显的抑制作用, 有必要对发酵培养基成分进行优化。固态发酵条件不易控制,葡萄糖氧化酶一般通过微生物液体发酵制得, 黑曲霉发酵培养基一般包括尿素、葡萄糖、KH2PO4、CaCO3等成分,青霉培养基一般包括蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、KH2PO4、NH2NO3等成分(Rasul 等,2011)。发酵条件优化是在基础培养成分的基础上进行优化调整, 优化方法一般采取统计学方法,具体包括正交试验方法、响应面方法、Plackett-Burman 方法等。 例如,Farid 等(2013)利用响应面法对黑曲霉NRC9 深层发酵产葡萄糖氧化酶进行优化, 在最佳培养条件下发酵酶活达到170 U/mL, 且准确率高达96.6%以上。 对发酵条件的优化不仅要考虑到产酶效率,也要考虑到生产成本,从发酵经济学的角度来看, 发酵产品的产值主要是由产品的盈利能力和单位产品的生产成本驱动的, 二者综合考虑达到最佳值才能利于工业生产。 例如,Rasul 等(2011)利用玉米浆替代葡萄糖用于黑曲霉葡萄糖氧化酶的生产,发现不仅生产成本有所降低,替换之后菌株产酶性能也明显提高。

2 葡萄糖氧化酶提取纯化工艺

根据葡萄糖氧化酶发酵生产工艺的不同,采取的提取纯化工艺也不尽相同, 提取葡萄糖氧化酶需要通过细胞破碎将其从胞内或菌丝体释放进入发酵液,细胞破碎常采取高压匀浆、反复冻融、超声破碎、液氮研磨或几种方法联合应用的方式,且不同菌种采用方法有所不同 (Tribst 等,2013;Bankar 等,2009)。 然后通过差速离心或过滤的方式将葡萄糖氧化酶从发酵液中提取分离出来,完成粗酶液的制备。 提取完成以后需要对葡萄糖氧化酶进一步纯化, 目前用于葡萄糖氧化酶的纯化方法较多,初步纯化一般通过化学沉淀的方式,其中最常用的沉淀剂为硫酸铵(Simpson 等,2007)。化学沉淀剂的使用造成葡萄糖氧化酶中混有许多无机盐离子,需要对其进一步去盐纯化,去盐主要利用待分离产物的物化性质差异进行分离纯化,如表面电荷、表面疏水性、分子量的差异或者对某些配体的生物专一性,常采用离子交换层析、凝胶过滤层析、透析等相结合的方式。离子交换层析是将离子交换基如二乙氨乙基结合到惰性载体上,常用的载体有纤维素、交联葡聚糖等,然后根据酶蛋白所带电荷的不同进行洗脱分离的一种方法,具体分为阳离子交换层析和阴离子交换层析(Zia等,2013)。 葡萄糖氧化酶的等电点一般为4 ~5,因此常采用阴离子交换层析(Dai 等,2002)。 并且研究发现, 过氧化氢酶作为葡萄糖氧化酶生产过程中的主要杂质,其等电点在6.5 左右,因此可以利用二者之间等电点的差异来辅助纯化葡萄糖氧化酶, 以确保葡萄糖氧化酶不受过氧化氢酶的污染。凝胶过滤层析是根据分子大小不同进行分离,又称作空间排斥层析,常用载体为葡聚糖凝胶,又称作Sephadex 凝胶,根据葡萄糖氧化酶的大小常选用Sephadex G-200 凝胶层析 (Zia 等,2012)。此外, 葡萄糖氧化酶还可以采取液液萃取的方式进行分离纯化, 利用反向胶束萃取技术将葡萄糖氧化酶从液体中萃取出来, 反向胶束在非极性液体中形成疏水性基团在外的球状聚集体, 利用静电作用力将葡萄糖氧化酶从水相提取到有机相之中,避免了葡萄糖氧化酶与有机相的直接接触,为蛋白质在有机相中保存生物活性提供了良好的环境, 并且通过调整水相条件可以使葡萄糖氧化酶重新回到水相中,操作简单(An 等,2012)。 例如,Ferreira 等(2005)通过利用反向胶束萃取技术纯化葡萄糖氧化酶, 获得葡萄糖氧化酶酶活超过250 U/mg, 过氧化氢酶活性控制在0.1 U/mg 以下。 经过提取纯化之后的葡萄糖氧化酶最终经过冷冻干燥可制得成品。

3 葡萄糖氧化酶酶学特性改进工艺

葡萄糖氧化酶底物亲和力较弱, 稳定性和催化活性较低,会阻碍其在工业上的应用,因此需要对其酶学特性加以改进以满足工业应用的需求,目前常采用的方法有酶的固定化、化学修饰、基因工程改造等。

3.1 固定化 葡萄糖氧化酶的固定化是指将酶和不同的载体结合用以改善酶学特性, 通过葡萄糖氧化酶固定化技术可以提高其酸碱稳定性和热稳定性, 并且能够实现酶的反复使用, 增加利用率。 目前葡萄糖氧化酶的固定化研究主要集中在生物燃料电池或生物传感器的电极修饰方面,通过固定化技术将化学信号转为有效的电信号,通过物理吸附、化学交联、共价结合、微胶囊化等方法将葡萄糖氧化酶固定到不同的载体上, 然后将其修饰到不同电极上制成各类传感器。例如,Shan等(2009)通过将端羧基离子液体与聚乙烯亚胺通过共价键连接制备聚乙烯亚胺功能化离子液体,然后利用聚乙烯亚胺功能化离子液体固定葡萄糖氧化酶,将其用于制备电化学葡萄糖传感器。目前可用于葡萄糖氧化酶固定的载体种类较多, 其中纳米材料因其本身巨大的比表面积和多孔性而受到广泛关注。例如,熊志刚等(2010)将葡萄糖氧化酶固定到四氧化三铁纳米粒子上, 然后将这种复合纳米材料修饰到电极上制成葡萄糖传感器,纳米材料能够很好地保护葡萄糖氧化酶的生物活性,进而氧化葡萄糖生成过氧化氢,激发相应的电信号,且获得的电信号强度与葡萄糖浓度成正比,可以将其用于血液葡萄糖浓度监测。 目前随着固定化技术的发展, 虽然对葡萄糖氧化酶固定化处理后酶学特性会有所提高, 但固定化后的扩散约束和酶活性降低等问题限制了这种技术的广泛应用,因此需要进一步改进以获得更大效益。

3.2 化学修饰 葡萄糖氧化酶的化学修饰是从化学结构层面对其进行结构改造, 从而使得葡萄糖氧化酶的某些特性得以改善。 Xu 等(2017)发现, 通过有机酸酯聚合物原位聚合修饰葡萄糖氧化酶能够提高葡萄糖氧化酶的活性, 首先对丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸叔丁酯及乙二醇丙烯酸酯四种不同的单体进行原位聚合, 然后分别与葡萄糖氧化酶聚合生成聚合产物, 通过测定不同葡萄糖氧化酶聚合产物和游离葡萄糖氧化酶的生物活性和稳定性发现, 所有聚合产物的活性和稳定性均明显提高, 且亲水性聚合产物活性比疏水性聚合产物更高, 疏水性聚合产物比亲水性聚合产物具有更好的稳定性。此外,多糖与葡萄糖氧化酶形成糖苷也能提高酶的稳定性。 例如,Matos 等(2012)用交联羧甲基纤维素-β-环糊精对葡萄糖氧化酶进行化学修饰发现, 虽然得到的糖基化葡萄糖氧化酶的净含量有所下降, 但仍然保持了67%的初始酶活力,并且相比游离葡萄糖氧化酶,糖基化之后酶的Km 值较高, 热稳定性更好。 因此, 通过对葡萄糖氧化酶的化学修饰可以达到改善其酶学特性的目的。

3.3 基因工程和蛋白质工程 虽然葡萄糖氧化酶在天然状态下的表达量不高,抗氧化能力不强,但基因工程和蛋白质工程技术可以提高大规模生产葡萄糖氧化酶的能力。 Qiu 等(2016)为了获得高表达葡萄糖氧化酶菌株, 将黑曲霉葡萄糖氧化酶基因插入到带有pGAP 启动子的pGAPZαA 质粒中, 然后导入毕赤酵母中表达,30 ℃测定培养基上清液葡萄糖氧化酶酶活达到107.18 U/mL,重组酶活性比原菌株表达的酶活性高1.35 倍。Jiang 等(2015)研究葡萄糖氧化酶活性受到过氧化氢抑制的机制发现, 蛋氨酸可以被过氧化氢氧化生产成蛋氨酸亚砜,从而使葡萄糖氧化酶失活。为了防止葡萄糖氧化酶氧化, 设计用其他氨基酸取代蛋氨酸, 通过计算机辅助同源建模和CDOCKER 算法进行计算机辅助设计分析, 确定葡萄糖氧化酶突变体, 结果发现取代蛋氨酸之后的葡萄糖氧化酶抗氧化活性明显提高。 Tu 等(2019)为了提高葡萄糖氧化酶的热稳定性和催化活性,对产葡萄糖氧化酶黑曲霉进行诱变,结果发现最活跃的菌株M4 有6 个氨基酸发生了替换,最大酶活损失一半的温度明显提高,60 ℃的酶热失活半衰期提高至原来的8 倍左右。

4 葡萄糖氧化酶质量控制工艺

葡萄糖氧化酶质量控制主要考察酶活力、酸碱稳定性、耐热稳定性、储存稳定性等指标。 葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖具有很高的专一性,β-D-葡萄糖在C-1 位被氧化生成δ-葡萄糖酸-1,5-内酯,然后自发水解为葡萄糖醛酸。葡萄糖氧化酶酶活定义是每分钟将1 μmol/L 的β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖醛酸和过氧化氢所需的酶量作为一个酶活单位(U/mL)(刘春莹等,2019)。 目前在酶活力方面,葡萄糖氧化酶还没有相应的国家标准,一般应用于饲料和食品的酶活力应控制在50 U/mL以上。 常用的葡萄糖氧化酶测定方法有邻联茴香胺法、4-氨基安替吡啉法等(朱运平等,2019)。 一般情况下,葡萄糖氧化酶在37 ℃保持高酶活应大于30 min,冷冻干燥处理后的葡萄糖氧化酶制剂在-20 ℃下应保持稳定最少达6 个月, 固定化处理之后应用效果更好,加入木糖醇、山梨醇等多元醇对其有稳定作用(Ye 等,1988)。 达到酶活标准和稳定性标准的葡萄糖氧化酶在饲料和食品中应用时需要对其安全性和卫生性进行进一步评价,包括铅、砷等重金属离子含量、黄曲霉毒素B1 含量、致病菌个数等。 Konishi 等(2013)对产黄青霉提取的葡萄糖氧化酶制剂在商业用途中的安全性进行测定, 验证了葡萄糖氧化酶在饲料和食品中应用的安全性。

5 展望与挑战

目前葡萄糖氧化酶在饲料业和食品业市场潜力巨大, 成为许多生物专家和企业家的重点关注对象。 虽然多种微生物都可以生产葡萄糖氧化酶,仍然需要对发酵生产工艺不断优化,进一步控制发酵成本,改善其酶学特性,适应不同的市场需求,以便更加商业化地生产和利用葡萄糖氧化酶义。

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