浓缩苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌检测及控制措施研究进展

张晨星，崔丽佼，于有伟，张少颖，崔美林，王东芹，程晓雯

（山西师范大学食品科学学院，山西临汾 041004）

我国是苹果生产大国，苹果产量占世界总产量的65%。目前，随着我国经济的高速发展，贸易机会不断涌现，我国浓缩苹果汁的生产加工已形成一定规模。我国苹果汁出口量巨大，且多为浓缩苹果汁，但由于地理位置和种植环境的不同，各地苹果汁的质量参差不齐，且大部分苹果汁存在着酸土脂环酸芽孢杆菌含量超标的问题。酸土脂环酸芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，好氧或兼性厌氧，对人体并无较大伤害，但因耐热耐酸的特性使其无法在果汁加工过程中被消灭。酸土脂环酸芽孢杆菌存在于果汁中，其本身代谢产生的物质（如愈创木酚等）会影响果汁风味，降低果汁的产品质量及缩短果汁的贮藏时间。因此在生产过程中利用现有手段对酸土脂环酸芽孢杆菌进行检测及控制非常重要。

目前对于酸土脂环酸芽孢杆菌检测手段的分析，大多未从生产线这一源头入手。因此本文基于酸土脂环酸芽孢杆菌对果汁行业的危害，探讨了当前微生物检测及控制的各类手段应用于果汁生产线上的可能性，并探究了在生产过程中，如何控制酸土脂环酸芽孢杆菌，以期能够促进浓缩苹果汁行业的健康、快速发展。

1 酸土脂环酸芽孢杆菌的特性及对果汁行业的危害

1.1 酸土脂环酸芽孢杆菌的特性

酸土脂环酸芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，好氧或兼性厌氧，细胞直或近直的杆状，pH2～6可生长，菌体大小为（2.9～4.3）μm×（0.6～0.8）μm，在不利于菌体生长的条件下会形成芽孢，大小为（1.5～1.8）μm×（0.9～1.0）μm，41 ℃培养1～2 d，培养基上会形成边缘不整齐、表面光滑黏稠、不易挑起的乳白色圆形菌落[1-4]。酸土脂环酸芽孢杆菌的芽孢在典型的巴氏杀菌条件下（92 ℃、10 s）仍能够存活，细菌菌体在41～60 ℃、pH3.5～4.5可以很好地生长繁殖。

1.2 对果汁行业的危害

酸土脂环酸芽孢杆菌本身对果汁及人体安全没有较大的影响，但其耐热、耐酸的特点，使之在果汁加工过程中难以控制和除去。目前研究人员已经在各种果汁和饮料中分离出酸土脂环酸芽孢杆菌，例如苹果、柑橘、蓝莓、芒果、百香果、梨、西红柿、香蕉、杏、桃子、葡萄、番石榴、柚子和猕猴桃等果汁[5]。此外，果酱、调味品中也有发现[5]。酸土脂环酸芽孢杆菌在代谢时会产酸，但不会影响果汁本身的pH，仅在瓶子底部看到一定的浊度[6]。但其菌体在代谢过程中会产生一些次级代谢产物，如愈创木酚（邻甲氧基苯酚）、2,6-二溴苯酚以及2,6-二氯苯酚。愈创木酚具有烟熏味，会对果汁风味、品质造成严重影响，使果汁腐败，且容易通过嗅觉检测到[7]。因此，抑制苹果汁中的嗜热耐酸芽孢杆菌是目前亟需解决的重大问题。

果汁被酸土脂环酸芽孢杆菌感染后，产品不一定会变质，但酸土脂环酸芽孢杆菌的浓度、储存温度、热处理方式等因素会影响该菌的腐败作用[4]。

2 苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的检测方法进展

基于目前对酸土脂环酸芽孢杆菌的研究，出现了很多该菌的检测方法，之外还有利用光谱、基因的各种快速检测方法，这些方法不仅提高了检测的速度，还增加了准确率。

2.1 常规检测

常规检测主要包括微生物的形态特征、生长环境及生理生化特征等的测定。目前使用的常规检测方法是平板计数法，即通过提取果汁中的微生物进行平板培养后，观察微生物形态特征以判断是否为酸土脂环酸芽孢杆菌。平板检测法目前较为常用，但耗时长、工作量大，无法进行实时监控，但可以检测产品是否带菌。

2.2 基因检测法

目前16S rRNA是一种基于基因检测的非常快速且灵敏度极高的检测方法。Luo等[8]基于SHC的编码基因（shc）建立了苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的Real-time PCR检测体系，该方法在短时间内即可实现对样品中低浓度（＜10 cfu/mL）目标菌的检测。还有学者利用RT-PCR检测浓缩苹果汁中的耐热菌，在24 h得到检测结果，达到了快速检测的目的，但只能定性，不能定量[9]。张宇霞等[10]采用聚合酶链式反应（PCR）以及自动化核糖体基因分型RiboPrinter，对经过分离、筛选和纯化后的59株分离菌株进行鉴定，发现脂环酸芽孢杆菌标准菌株基因组DNA进行PCR扩增时，扩增出目的条带的最小模板量达到0.1 ng/mL。因此可以看出，应用基因检测的方法可以快速准确地检测出酸土脂环酸芽孢杆菌，但是仅仅适用于最终产品的检测，无法应用于整条生产线。

2.3 仪器分析法

目前随着科技的发展，越来越多的检测仪器被开发出来，主要有高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、气相色谱-嗅觉测定（GC-O）、电子鼻技术和分光光度计法等。分光光度计法应用最普遍，但相比于其他方法准确性较差，且对于糖度较大的一些浓缩果汁检测效果较差。

李二虎等[11]采用电子舌对7种市售果汁饮料以及接种脂环酸芽孢杆菌后的样品进行测定，通过数据分析，可以将接种酸土脂环酸芽孢杆菌的果汁区分开。许灿等[12]利用电子鼻结合主成分分析，快速、准确地区分了正常产品与异常产品。Concina等[13]利用电子鼻检测了软饮料中的酸土脂环酸芽孢杆菌，进行早期诊断，该仪器能够在极低的细菌数（Dozens/mL）下识别受污染的产品，具有极好的分类率（几乎100%）。因此利用电子鼻、电子舌等技术来检测其中的酸土脂环酸芽孢杆菌及其产物是可行的。可见，采用现代检测仪器可以快速准确地检测出果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的污染，可以尝试考虑将仪器与生产线结合，用于快速检测、实时监控生产过程中酸土脂环酸芽孢杆菌的存在与污染。

2.4 代谢产物检测法

研究报道，脂环酸芽孢杆菌主要的代谢产物是愈创木酚[5]，微量的愈创木酚即可带来极不愉快的气味。愈创木酚在H2O2和过氧化物酶的参与下可以转化成褐色的四聚愈创木酚，通过测定反应混合液在470 nm下的吸光度变化，实现对愈创木酚的快速定性及定量检测[14]。目前，已经有企业研制出了商业化的愈创木酚检测试剂盒。高效液相色谱法和GC-MS法是愈创木酚检测中比较常用的方法[5]。刘新梅等[15]采用气质联用法（GC-MS/MS）和显色法对愈创木酚含量进行测定，发现两种方法均可用于快速检测酸土脂环酸芽孢杆菌。但是代谢产物检测的方法，只能用于加工完成的产品及其贮藏过程中的检测，不能用于整条生产线的检测。

2.5 酶联免疫

通过抗原与抗体之间的特异性结合反应来确定某种物质的方法被称为酶联免疫法，这种方法简单、快速、灵敏度高、特异性强，目前已被广泛地用于食品中有害微生物的检测。Li等[16]通过采用酶联免疫吸附法检测浓缩苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌，发现采用葡萄球菌蛋白可以检测出最低浓度为105cfu/mL的酸土脂环酸芽孢杆菌。Li等[17]还采用了双抗体夹心酶联免疫吸附法检测酸土脂环酸芽孢杆菌，发现最低检测限为5×103cfu/mL。酶联免疫的方法可以快速高效地检测出浓缩苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌，但成本高、操作繁琐，应用于生产线难度大，但可以用于产品的快速检测。

目前，随着科技的发展，大多数检测手段的灵敏度和效率均不断提高，但是针对整条生产线酸土脂环酸芽孢杆菌的检测手段还未有提出，因此如何将各种手段联用，实时监控整条生产线上的酸土脂环酸芽孢杆菌还有待于进一步的研究。

3 苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的控制措施

传统的巴氏杀菌无法彻底将果汁及生产线上的酸土脂环酸芽孢杆菌杀灭，酸土脂环酸芽孢杆菌的芽孢也极难消灭，芽孢会对生产用的苹果及生产出的苹果汁产生污染。因此在快速准确的检测方法的基础上，更需要研究出高效且对原材料及产品不会造成太大营养损失的控制措施。

3.1 物理措施

3.1.1 加热处理

巴氏杀菌是应用于饮料产品杀菌的主要措施，同时也是控制酸土脂环酸芽孢杆菌的主要方法，但酸土脂环酸芽孢杆菌具有独特的耐热性，其芽孢经巴氏杀菌约92 ℃、10 s处理仍能存活。Vieira等[18]发现使用HTST（高温短时杀菌）在115 ℃条件下处理8 s，酸土脂环酸芽孢杆菌的芽孢数量减少了105cfu/mL。Lopez等[19]利用时间温度积分仪，模拟工业加热过程，将酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢置于其中，迅速升温至93 ℃，保持2 min，发现在缓冲液中芽孢数下降约102cfu/mL，在果汁中芽孢数下降约10 cfu/mL。但对果汁产品进行热处理会导致果汁产品风味物质及营养成分损失、感官品质下降等问题。

3.1.2 超高压处理

利用高压灭菌是对无需加热食品研发出的一种新型保鲜技术，通过高压使微生物中的蛋白质、核酸变性，从而达到杀菌的目的。普通的高压处理仅能杀灭酸土脂环酸芽孢杆菌营养菌体，对芽孢的杀灭效果较差[20]。Bevilacqua等[21]研究发现，50～170 MPa的高压对脂环酸芽孢杆菌的营养菌体和芽孢的抑制效果均不显著；而超高压技术最高压强可达400 MPa，可以在常温甚至低温下起到杀菌作用[22]。Roig等[23]使用300 MPa的压强处理酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢，使芽孢数下降了105cfu/mL。可以看出超高压对芽孢和菌体的杀菌效果更加明显，但是其灭菌效果会受到温度、时间以及产品中糖和可溶性固形物的影响，因此如何控制各种因素，在保证灭菌效果的基础上尽量不影响产品自身的理化性质是急需解决的一个问题。

3.1.3 紫外处理

紫外杀菌属于冷杀菌技术，在杀菌过程中不需要加热，因此对于果汁来说是一种非常好的杀菌方式，但紫外光谱的范围为100～400 nm，对设备的要求比较高。Tremarin等[24]利用7种不同强度的紫外光分别处理酸土脂环酸芽孢杆菌菌体及芽孢，发现随着时间的增加，菌体数量均呈线性递减，说明利用紫外线进行杀菌可以破坏酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体和芽孢。但也有研究报道，紫外线对不同种类果汁中微生物的杀菌效果有很大区别，且对于一些产品因果汁内含有的固体物质含量有差别，杀菌参数需要进行一定的调整[25]。因此，如何有效地利用紫外线杀灭苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌还需要进一步的研究。紫外杀菌受光谱的限制，对设备要求较高，成本也相应较高，因此对于中小型企业来说，实施紫外杀菌需要进一步探讨。

3.1.4 欧姆加热处理

欧姆加热（ohmic heating）亦称作电阻加热、焦耳加热、电力加热等。20世纪初期，人们把鲜牛奶通过加有电压的平行板，得到了“电力消毒牛奶”。欧姆加热的基本原理是利用食品本身的介电性质，当电流通过时，引起食品温度升高，从而达到直接均匀加热杀菌的目的[26]。耿敬章等[27]对苹果汁进行欧姆加热处理，以尝试消除苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌，结果表明，在70 ℃、250 V、pH3.5的条件下，杀菌率高达90%以上，且欧姆加热对苹果汁的各项理化指标不会造成太大的影响，从而保证了产品的质量。但欧姆加热对液体的黏度要求较高，黏度过小，颗粒会沉淀在加热器底部，导致固液分离，受热不均匀；黏度过大，固相与加热器管壁以及不同固相之间的相互磨损都会破坏颗粒的结构完整，因此如何将欧姆加热处理利用到生产线中还有待于进一步研究。

3.1.5 超声波处理

超声波是一种有效的灭菌方法，已成功用于废水处理、饮用水消毒等领域，在液体食品灭菌中的应用也有较多的研究，如啤酒、橙汁、酱油等。相比于传统高温加热杀菌工艺，超声波杀菌既不改变食品的色、香、味，也不会破坏食品组分，而且超声空化能提高细菌的凝聚作用，使细菌毒力丧失或死亡，从而达到杀菌的目的。但是超声波杀菌的方法对于酸土脂环酸芽孢杆菌及其芽孢的抑制效果并不明显。有研究发现，用330 W、30 kHz的超声波处理10 min后，浓度为105cfu/mL的酸土脂环酸芽孢杆菌的芽孢在数量上没有产生明显变化[28]。胡贻春[29]研究发现，用500 W超声波处理苹果汁30 min后，最高可杀死约80%的酸土脂环酸芽孢杆菌，但会降低苹果汁中的总糖含量；运用700 W超声波处理苹果汁60 min后，其透光度下降至无法达到质量标准（国标要求透光度不小于95%）。因此采用超声波杀菌需在杀菌之后进行澄清处理，操作更加繁琐；消毒不彻底，影响因素较多，一般只适用于液体或浸泡在液体里的物体，且处理量不能太大。对超声波在食品非热杀菌领域的应用研究还不够系统和全面，对具体的食品成分以及最终导致的潜在安全性问题研究还不足，因此超声灭菌在苹果汁方面的应用还需要进一步的研究和讨论。

3.1.6 其他措施

目前在食品行业中除了以上几类物理杀菌方式之外，还有其他一些杀菌方式，如利用超滤系统过滤果汁进行除菌灭菌，可以有效去除水中的微粒、胶体、热源以及各种有机物质，与传统的分离技术相比，超滤处理工艺是在常温下进行，适合对药物、酶、果汁等进行分离，且处理过程中不需要加热和添加化学试剂，不会产生污染，操作简单。章樟红等[30]采用孔径为0.1 μm的钛合金膜超滤系统过滤除菌，效果基本达到商品果汁的卫生安全要求。微波杀虫灭菌是使食品中的微生物同时受到微波热效应与非热效应的共同作用，使其体内蛋白质和生理活性物质发生变异，而导致微生物体生长发育延缓和死亡，达到食品灭菌、保鲜的目的；具有时间短、速度快、营养成分和风味损失少等特点。但这些措施对于设备要求很高，对中小型企业来说想要实现大规模处理比较困难，因此如何能够有效地利用这些措施抑制苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌还需要进一步的研究探讨。

3.2 化学措施

3.2.1 防腐剂

目前在食品中常用的防腐剂主要有苯甲酸及苯甲酸盐、山梨酸及山梨酸盐、脱氢乙酸及钠盐类、双乙酸钠、乳酸钠等。Cai等[31]对多种防腐剂进行研究，发现只有脱氢乙酸、肉桂酸及ε-聚赖氨酸可以有效抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的生长及因其次级代谢产生的愈创木酚，增加270 mg/L脱氢乙酸、108 mg/L肉桂酸、100 mg/Lε-聚赖氨酸，酸土脂环酸芽孢杆菌数量分别减少了3.43、3.17、4.78 cfu/mL，且贮藏14 d后未检测到愈创木酚。Kawase等[32]在研究中发现，在果汁中添加用超临界技术处理过的苯甲酸微粒，发现其对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢杀灭效果远大于未经处理的苯甲酸钠和苯甲酸颗粒，但此方法较费时，不适合工厂加工使用。目前消费者对食品防腐剂这一类物质认可度不高，如何开发出让消费者接受且对食品本身及其营养物质没有影响或影响不大的新型防腐剂是目前研究的热点。

3.2.2 氯及其化合物

氯气与水反应生成次氯酸，次氯酸具有强氧化性。除了氯气之外，氯的各种化合物也同样具有杀菌效果，亚氯酸可以有效抑制沙门氏菌与李斯特菌等食源性病原菌的生长[33]。Lee等[34]在研究中发现，通过控制二氧化氯的流速对苹果表面的酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢处理后进行培养，发现芽孢暴露在高、中流速情况下，其数量降低到无法检测的水平，暴露在低速释放情况1、2、3 h后，芽孢数量分别减少102.7、103.7、104.5cfu/mL。之后Lee等[35]将酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢接种于苹果表面，使用2.68×10-4mg/L浓度的亚氯酸处理20 min后，苹果表面的芽孢数下降至102cfu/mL。但是由于亚氯酸很不稳定，室温下极易分解，产生氯气、二氧化氯和水，对人体有害，所以导致其应用范围受到限制。因此利用氯及其化合物可以有效抑制酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的生长，但吸入过量的氯气对人体健康有极大的影响。所以如何通过氯及其化合物抑制酸土脂环酸芽孢杆菌，同时对人体不会造成伤害是食品行业需要进一步研究的问题。

3.2.3 臭氧

臭氧是一种强氧化剂，能够破坏微生物的膜结构，作用于蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，从而导致细菌死亡[14]。臭氧具有杀菌作用强、不存死角、无残留和无污染的优点，广泛地应用于食品及制药中。臭氧虽然无毒无害，但要求被处理环境的相对湿度达到60%以上，才能保证良好的消毒效果；当臭氧浓度达到一定量时，会对人体呼吸系统等造成一系列伤害；且臭氧发生器大多使用高频高压供电，因此对于操作人员有严格的要求。可见，如果想在生产线上使用臭氧灭菌，必须对操作人员进行培训，且在产品的后续加工过程中采取一定的脱氧措施，以脱去产品内的臭氧，否则臭氧的强氧化性可能会引起产品内营养成分的氧化及口感的劣变。

3.2.4 天然化合物

目前广大消费者对于食品安全问题越来越重视，采用各类食品添加剂来抑制食品中的有害微生物逐渐不被广大群众所接受，在这一背景下，科研人员逐渐转向开发天然化合物及其提取物来抑制食品中的有害微生物。

（1）香料提取物

科研人员发现，我们日常生活中常用的多类香料的提取物有较好的杀菌作用，科研人员开始将香料提取物应用于食品保鲜的效果研究。Piskernik等[36]分别将两种迷迭香的萃取物添加于含有105cfu/mL酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的苹果汁中，8 h后，芽孢数量分别下降100.6、101.5cfu/mL，并且果汁本身的理化性质没有发生明显的变化。Ruiz等[37]研究发现，胡椒提取物对于酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的最低抑菌浓度（MIC）及杀菌浓度（MBC）均为7.8 μg/mL，相同浓度下酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢数与对照组相比下降约10 cfu/mL。

虽然香料提取物对食品中的各类有害微生物有较好的抑制作用，但是香料提取物浓度较高，气味较重，对肉制产品的影响不大。而将香料提取物置于果汁类产品中，对果汁本身的风味却有极大的影响。因此添加各类香料提取物但不会对产品本身造成影响是目前果汁产业需要研究的重点。

（2）其他提取物

除了各类香料以外，还有一些天然物质及其提取物有较好的抑菌效果。Molva等[38]将石榴提取物加入无菌苹果汁中，并接种酸土脂环酸芽孢杆菌菌体与芽孢，调整菌液浓度达到105cfu/mL，10 d后，试验组菌体数下降了约103cfu/mL，芽孢数下降了约101.6cfu/mL，且菌体与芽孢表面均有不同程度的凹陷。还有学者将葡萄籽提取物添加到无菌苹果汁中并接种浓度为105cfu/mL的酸土脂环酸芽孢杆菌菌体与芽孢，结果发现14 d后，试验组菌体数量下降约103.5cfu/mL，芽孢数下降约102cfu/mL，且菌体与芽孢表面均受到不同程度的损伤[39]。可以看出葡萄籽提取物能一定程度地抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的营养菌体，但其抑菌效果较差且比较费时。因此虽然提取物可用于抑制酸土脂环酸芽孢杆菌，但效果并不明显，是否能够通过其他物理、化学措施或与多种提取物结合的方式来提高其抑菌效果，还有待研究。

3.3 生物措施

乳酸链球菌素亦称乳链菌肽（Nisin），是利用生物技术提取的一种纯天然、高效、安全的天然生物活性抗菌肽。Nisin对包括食品腐败菌和致病菌在内的许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用，是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。所以目前很多学者开始研究将Nisin应用于食品贮藏行业。日本研究人员Komitopoulou等[40]研究发现，温度为25 ℃时，Nisin对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的MIC为5 IU/mL，在80～95 ℃，Nisin可使酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的D值下降40%。基于目前的研究发现，Nisin对苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制作用并不明显，但是因为乳酸链球菌素有良好的热稳定性，在生产中经常与加热处理结合使用，以达到更好地抑制有害微生物的目的。

3.4 综合措施

基于目前的抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的措施效果并不显著，因此有学者研究将两种抑菌方法结合起来抑制酸土脂环酸芽孢杆菌，以达到更好的效果。Luma等[41]将高温和高压相结合来处理酸土脂环酸芽孢杆菌的芽孢，以观察这种方法是否对芽孢的失活和萌发存在影响，结果表明，在70 ℃下，芽孢数量减少了102.5cfu/mL（300 MPa）和102.4cfu/mL（600 MPa）。Gálvez等[42]将UV-C和超高压均质（UHPH）结合以抑制苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的活性，他们发现当入口温度为80 ℃时，300 MPa超高压处理可以使澄清苹果汁中104.8cfu/mL的酸土脂环酸芽孢杆菌失活。UV-C处理在20 ℃下以21.5 J/m2的剂量能杀灭105.5cfu/mL浓度的酸土脂环酸芽孢杆菌。与UV-C单次处理相比，在14.3、21.5 J/m2剂量下，先应用UHPH有助于获得更高的酸杆菌孢子减少率。

Nisin可用于食品行业的灭菌处理，但是目前也有研究发现Nisin对于苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制作用并不明显，因此有学者开始将Nisin与其他处理方式结合起来以抑制果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌[37]。

3.5 小结

目前的研究表明，各类抑制措施都有一定的抑制效果，但是目前并不能全部应用于实际生产中，应用于生产中的主要还是物理方式，且臭氧、超高压等技术还均处于实验室研究阶段，无法大规模应用于工厂生产。两种措施相结合的抑制措施可以更好地抑制酸土脂环酸芽孢杆菌及其芽孢的生长、萌发，但就目前情况来说，有些方法以当前的仪器设备还不能达到在生产上的大规模使用的程度。因此，应加快研究快速高效且对食品本身的营养成分及风味无太大影响的控制措施，来提高果汁行业的经济效益。

4 生产工艺控制措施

浓缩苹果清汁的生产工艺流程为苹果验收→流水输送（清洗）→拣选→破碎→榨汁→前巴氏灭菌（95～98 ℃、30～60 s）→酶解（50～53 ℃、2 h、约11.5°Bx）→超滤→树脂吸附→浓缩（≥70°Bx）→后巴氏杀菌（95～98 ℃、30～60 s）→无菌灌装→贮存（0～5 ℃）等。

从生产线的总体角度来看，11.5°Brix果汁的pH在3.6～4.3之间，生产线的物料温度在50 ℃左右，从微生物生长的营养角度和物理条件看，生产线上的果汁非常适合微生物的生长。原料、树脂吸附和设备管路死角是菌源，一旦把酸土脂环酸芽孢杆菌引入生产线，就必然污染果汁，却不一定泛滥。酶解工序、贮存罐缓冲等工序为酸土脂环酸芽孢杆菌的生长提供了时间，此时，如果果汁受到污染，极易爆发泛滥。

4.1 原料控制

酸土脂环酸芽孢杆菌来源于土壤而非苹果本身，苹果原料在采摘过程中极易受到菌体的污染。采摘的苹果原料在向果汁厂运输的过程中，通常先装在包装袋中，然后运往果汁厂。如果包装袋没有清洗干净，也会产生污染。原料进入工厂后，在果槽边卸车，工人将包装袋划破，苹果直接倒入果槽。如果工人的工服或果槽没有有效清洗，也会使苹果感染酸土脂环酸芽孢杆菌。果槽中的苹果通过流水输送到车间进行压榨取汁。因此，原料入厂环节是控制酸土脂环酸芽孢杆菌的第一道防护，对于整个果汁的酸土脂环酸芽孢杆菌控制至关重要。

原料从采摘到进入车间，要历经许多环节，完全不接触酸土脂环酸芽孢杆菌从理论上讲几乎是不可能的。问题的关键是在采摘、运输和装卸过程中，尽量确保包装袋、车厢和果槽干净，每完成一轮作业过程，彻底清洗车厢和包装袋。落地的苹果要丢弃或彻底洗净之后再使用。苹果从果槽向车间用流水输送的过程中，逐级换用清水，避免输送的水流被污染。目前在果汁厂一般采用逆向逐级换水的方式，在即将入车间的一段用最干净的水清洗，然后依次向前一工序换水，将第一工序的水排放掉。这样在整个输送过程中，始终保持水的清洁，将耐热菌的量控制在最低水平。

4.2 生产线清洗

生产线是酸土脂环酸芽孢杆菌生长最主要的位置，生产线的干净与否决定着果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的数量。在浓缩果汁生产企业，一般是24 h洗一次生产线。以超滤为界，超滤以前的浊汁段和以后的清汁段要分开清洗。清洗工序为水洗→1%的氢氧化钠清洗→水洗→1%的杀菌剂清洗→水洗，在果汁厂俗称“5步法”。清洗的水温为75 ℃，清洗时间为15～25 min，清洗剂的浓度、温度、清洗时间等可根据生产线酸土脂环酸芽孢杆菌的污染情况进行适当调整。

正常情况下清洗，理论上可以控制酸土脂环酸芽孢杆菌。但是上述清洗方式对酸土脂环酸芽孢杆菌的控制极其有限，许多工厂受酸土脂环酸芽孢杆菌污染严重。工厂生产线在进行安装时，往往留下一些易忽视且不易清洗的死角，这些死角逐渐的成为生产线的菌源。同时，由于原料季节性的特点，果汁厂分为榨季和非榨季，非榨季进行技术改造或安装新设备，又容易引入新的死角。

生产线上的交叉作业也会引起污染。例如不同的工序之间由于工具的串用引起的污染。比如一个机修工在巡检时，在卫生比较差的破碎工序使用了扳手等工具，然后在包装工序使用同一个工具进行检修，则可能会带来交叉污染。为此，果汁厂一般要求电工、机修工逆生产工序进行巡检，将污染降低到最小。另一种情况是车间的水蒸汽有时在不同的工序之间漂移，会从有菌区飘向无菌区，在无菌区的上方冷凝，水滴下落，刚好滴入有清汁的贮存罐，则相当于给果汁接种了酸土脂环酸芽孢杆菌，短时间内酸土脂环酸芽孢杆菌泛滥。为此，生产线上的物料尽量不要裸露在空气中，贮存罐上部的孔盖通常是合着的。不同工序之间尽量用格挡完全隔开，避免空气、水汽等串联。

保持车间环境卫生也是非常重要的。车间要经常开通风设备，保持正压换气，风机上的过滤设备要勤于检查。车间争取不积水，不积尘，物料摆放有序（可借助于5S管理）。通过GMP（良好操作规范）和SSOP（标准卫生操作程序）措施，保持车间良好的卫生，避免空气中可能含有的酸土脂环酸芽孢杆菌对生产线上的设备或物料造成污染。

4.3 物料在线时间的控制

浓缩果汁的物料在线时间从原料进入车间开始，历经一系列工序，到最终成品下线，一般需要15～25 h。物料在线时间越短，感染酸土脂环酸芽孢杆菌的机会就越少。如压榨、杀菌、超滤等工序，用时较短；而酶解、浓缩（等待一个大罐满）等工序，物料通常有一个在线作用时间，恰好为酸土脂环酸芽孢杆菌的生长创造了有利条件。即使污染了酸土脂环酸芽孢杆菌，如果在线时间短、菌体数量有限，杀菌工序可以有效杀灭酸土脂环酸芽孢杆菌。反之，微生物泛滥，杀菌工序也无能为力。

近年来，果汁厂原料紧张，在此情况下，生产线需要频繁开机，生产线上容易发生断料或积料。断料时，生产线不能连续运行，如果不及时清洗，死角区会导致微生物泛滥。积料时，主体物料也会大面积发生微生物泛滥。在上述情况下，评估每日的原料采购量，通过调整生产线的单位时间进料量。原料充足时可在最大参数下进行，原料不足时则降至最低参数后进行，或者2～3 d开一次机，以确保生产线连续运行。

此外，停水停电或设备故障，也会造成物料在线时间延长，这种现象在果汁厂较常见。对于停水停电，尽量与供水供电部门协调，在停水停电以前，按照既定的方案有秩序地将物料安排好，避免积压在线上。加强设备巡检，争取提早发现问题，在清洗生产线等时间方便时进行维修维护。对于突然停水停电或设备故障，一旦发生，则采取应急响应预案，根据具体情况对生产线进行酸土脂环酸芽孢杆菌污染状况的有效合理评估，争取在酸土脂环酸芽孢杆菌受控的情况下做到生产效益最大。

4.4 高温杀菌

浓缩苹果汁生产时，有两个工序涉及到高温处理。第一个是酶解前的浊汁（95～98 ℃、30～60 s），主要目的是灭酶，防止果汁过分褐变，兼有杀菌作用。第二个是灌装前的浓缩汁（95～98 ℃、30～60 s），主要目的是杀菌。另外，果汁进行浓缩时，第一个工序也是一个温度比较高的过程（90 ℃左右），这是便于高温减压浓缩。这几个工序的高温杀菌对于控制霉菌、酵母菌、细菌、大肠杆菌等普通的有害微生物是完全满足要求的；对于少量耐热菌，从微生物的杀菌曲线角度而言，一般的高温处理也是有一定效果的；但对于生产线上泛滥后的耐热菌，控制效果极其有限，几乎不起任何作用。

为有效控制酸土脂环酸芽孢杆菌，有的生产线在灌装前尝试采用大约120 ℃、30～60 s的高温处理果汁，对于控制酸土脂环酸芽孢杆菌的效果非常明显。但是，如此高的温度处理也会造成一系列问题：一是容易造成浓缩果汁营养损失，果汁中的维生素、多酚、黄酮等营养物质都是热敏性的，损失非常大。其次，高温处理的浓缩果汁会过度发生非酶褐变，果汁的颜色加深，商品性降低；再者，过分高温处理导致浓缩果汁中的羟甲基糠醛（羟甲基糠醛是葡萄糖经过一系列脱水形成的产物）含量升高，产生焦糊味；最后，过度高温处理加速杀菌设备的橡胶垫老化，容易发生残渣剥落，最终进入成品果汁，导致果汁产生异物。

有专家建议将酶解前的浊汁进行高温杀菌，因为此时的果汁浓度约为11.5°Bx，将果汁进行预浓缩（21°Bx左右），可以避免发生一些浓缩汁（70°Bx）杀菌可能出现的副作用，如严重褐变、羟甲基糠醛升高、营养损失等。即使可能有橡胶垫残渣，后面还有几道过滤工序可以有效去除。从食品化学反应的动力学角度看，果汁浓度低时，各种成分相对含量也低，化学反应不剧烈，因此这种建议是可行的。但是，前提条件是前面高温处理后，到灌装前，还有很多工序，一定要确保这些工序完全无菌。否则，一旦果汁再次被酸土脂环酸芽孢杆菌污染，前面的高温处理将功亏一篑。在实际的生产线上，果汁经历多个工序而没有接触酸土脂环酸芽孢杆菌，通常是不可能的。

因此，尽管高温杀菌能够有效控制酸土脂环酸芽孢杆菌，生产中还是慎重选用。在第一道高温处理时建议采用，在灌装前的浓汁段是不宜采用的。

4.5 过滤除菌

酸土脂环酸芽孢杆菌的形体大小为（2.9～4.3）μm×（0.6～0.8）μm，在不利于菌体生长的营养条件下会形成大小为（1.5～1.8）μm×（0.9～1.0）μm近端或终端椭圆形芽孢，采用孔径小于0.22 μm的滤材可以有效去除酸土脂环酸芽孢杆菌。生产中目前一般在果汁灌装之前过滤。通常采用板框压滤机，孔径为0.22 μm的纸板滤材。过滤的是浓缩汁，浓度高，阻力大，过滤速度慢。纸板在过滤前需要清洗，一般过滤几个批次后，纸板需要更换。过滤时要特别关注压力，如果压力过大，容易发生纸板击穿，引起果汁污染。压力过小，则过滤速度慢，影响生产效率。纸板的成本比较高，生产中如果通过卫生条件能有效控制酸土脂环酸芽孢杆菌，一般不使用纸板过滤。当然，如果有客户提出果汁中的菌体数量必须小于一定数值，不论菌的死活，此时只能通过过滤来除菌。

纸板是一次性使用的，成本比较高，且有击穿风险。为了克服这些缺陷，有专家建议采用陶瓷膜过滤，陶瓷膜可以重复使用，降低成本；膜的材质也比纸板结实，减少击穿的危害。但是，陶瓷膜在过滤时，一旦被堵死，特别是一些无机盐堵死，疏通比较困难。果汁中的矿物质含量比较高，极易发生堵膜现象。

4.6 小结

实际生产中可通过消除菌源，或改变环境条件，达到抑制耐热菌的生长或消除耐热菌的目的。保持原料干净、彻底清洗生产线、缩短物料在线时间这三项措施也是为了确保生产线的干净卫生，基本无酸土脂环酸芽孢杆菌或其没有泛滥，通过一般的加工措施可以有效控制。因此保持生产线的干净卫生和正常生产运行对于控制耐热菌而言是非常有利的。而高温杀菌或过滤除菌，通常是在耐热菌泛滥时才使用。此时生产成本加大，生产的果汁质量也降低。但基于目前的技术来看，其是一种相对有效的补救措施。企业在生产过程中基于当前现有的技术只能尽量地减少酸土脂环酸芽孢杆菌的数量，没有办法将其完全杀灭。在整条生产线上使用各类技术处理果汁，可以有效地抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的生长繁殖，以达到果汁的生产要求及行业标准。

5 展望

作为果汁产业中的关键控制因子酸土脂环酸芽孢杆菌的研究历史已有30多年。随着我国果蔬产品贸易量的增大及全球各国对食品安全问题的关注，减少或杀灭浓缩苹果汁中的酸土脂环酸芽孢杆菌是非常重要的。目前看来，能够应用于控制和检测苹果汁中酸土脂环酸芽孢杆菌及其芽孢的方法有很多，不论是物理、化学、生物还是各类方法相互结合起来，都可以有效地对酸土脂环酸芽孢杆菌进行检测和控制，但是我国产出的浓缩苹果汁产品还是存在一系列问题。基于苹果汁从源头到产品整个复杂的产业链，结合科学研究和生产实际，以保障果汁产品的质量，提高果汁行业的整体水平，是现阶段果汁加工过程中的新趋势。