氟维司群细菌内毒素检查方法学研究

王以云 王秀艳 段春艳

摘要：目的：建立氟维司群细菌内毒素检查方法。方法：按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1143细菌内毒素凝胶检查法的要求，采用两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素干扰试验，并对样品进行细菌内毒素检查。结果：氟维司群用细菌内毒素检查用水和二甲基亚砜溶解成10mg·ml-1的溶液稀释至80倍时，对细菌内毒素检查无干扰。结论：可采用此法对氟维司群的细菌内毒素进行检查。

关键词：氟维司群;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验

内毒素是革兰阴性细菌细胞壁脂多糖，极微量（1ng/kg）的内毒素进入人体即可引起发热反应。大剂量的内毒素可引起机体发生内毒素休克、弥散性血管内凝血、多器官衰竭等反应，甚至导致死亡。故注射剂中内毒素内毒素含量应严格控制，生产注射剂所使用的原料中内毒素的含量也应进行控制，以保证注射剂的安全性。

氟维司群是一种抗肿瘤药，属于竞争性雌激素受体拮抗剂，可阻断雌激素的作用而本身没有激动受体作用。主要用于绝经后（包括自然绝经和人工绝经）妇女在抗雌激素辅助治疗后或过程中复发、或在抗刺激素治疗期间疾病进展的雌激素受体阳性的局部晚期或转移性乳腺癌。本研究对氟维司群细菌内毒素检查的可行性进行方法学研究，为该原料质量标准中制定细菌内毒素检查提供依据。

1、仪器与材料

1.1实验材料

鲎试剂，灵敏度为0.06EU·ml-1，規格：0.1ml，批号2003252，湛江安度斯生物有限公司，批号19090412，福州新北生化工业有限公司;细菌内毒素工作标准品，效价9000EU·支-1，批号150800-201601，厂家中国食品药品检定研究院;细菌内毒素检查用水50ml·瓶-1，批号：1910100，湛江安度斯生物有限公司;二甲基亚砜，批号200227，西陇科学股份有限公司。

1.2仪器

GZX-9246MBE电热恒温干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），XW-80A型漩涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司），HH-8型恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司），XSR204型万分之一天平（梅特勒-托利多），移液器（赛托利斯）。

1.3样品

氟维司群，批号：633200201、633200301、633200302，山东新时代药业有限公司。

2、方法与结果

2.1菌内毒素限值的确定

根据企业内控标准，确定原辅料的细菌内毒素限值（总细菌内毒素之和小于制剂限度）。质量标准规定：每1mg氟维司群中含内毒素的量应小于0.5EU·mg-1。

2.2鲎试剂灵敏度复核

按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1143细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂灵敏度复核，结果见表1。两批鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品检查，λc与λ均一致，结果均复核规定。

2.3最大有效稀释倍数的计算

氟维司群供试品溶液的配制：称取供试品100mg，加入1mlBET水，再加入9ml的二甲基亚砜，混匀溶解既得C=10mg·ml-1的供试品溶液。

最大有效稀释倍数（Maximum valid dilution，MVD）MVD= CL/λ为根据，C为供试品溶液浓度10mg·ml-1，L为细菌内毒素限值0.5EU·mg-1，λ为鲎试剂的灵敏度0.06EU·ml-1，则MVD=83倍。

2.4干扰实验

按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1143细菌内毒素检查法，用两个厂家标示灵敏度为0.06EU·ml-1的鲎试剂进行干扰试验。根据数据计算MVD=83倍，方便样品的稀释及干扰实验标准内毒素的加入，选择80倍进行干扰试验。

称取供试品100mg，共称取四份，每份分别加入1ml含100EU/ml、50EU/ml、25EU/ml、12.5EU/ml标准内毒素溶液，每份再分别加入9ml的二甲基亚砜，溶解混匀后每份溶液用细菌内毒素检查用水依次稀释10倍、20倍、40倍、80倍制成含内毒素浓度为0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的供试品溶液。每份供试液稀释10倍时产生絮状沉淀，静置沉淀取水相进行下一步稀释。

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成浓度为0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的内毒素标准溶液;同时进行阴性对照。根据公式antilg（∑X/4）分别计算出内毒素标准溶液和含供试品的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值，试验结果见表2。

从以上干扰结果，内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值均在0.5λ～2λ之间，含供试品的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值均在0.5λ～2λ之间，80倍供试液对鲎试剂与细菌内毒素反应无干扰作用。

2.5供试品内毒素检测结果

将三批供试品分别称取100mg，加入1ml细菌内毒素检查用水，再加入9ml的二甲基亚砜，溶解混匀后用细菌内毒素检查用水依次稀释10倍、20倍、40倍、80倍制成供试品溶液;供试液稀释10倍时产生絮状沉淀，静置沉淀取水相进行下一步稀释。按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1143细菌内毒素检查法，进行细菌内毒素检查，结果见表3。三批供试品细菌内毒素均符合规定，即内毒素含量小于0.5EU·mg-1。

3、讨论

细菌内毒素随注射剂进入人体血液所导致的“热源反应”是注射剂临床应用中发生率较高的不良反应，细菌内毒素是注射剂质量检查的重要项目。氟维司群作为注射剂原料，从生产源头控制细菌内毒素。本文按照《中华人民共和国药典》2020版四部通则1143“细菌内毒素检查法—凝胶法”进行细菌内毒素检查法研究，结果表明氟维司群用溶剂溶解混匀后，稀释80倍时对细菌内毒素检查无干扰作用，可在大于或等于此稀释倍数下采用凝胶法进行氟维司群的细菌内毒素检查，从而控制供试品的内毒素含量在限值范围内，保证产品质量，确保患者用药安全。

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