干旱胁迫下不同中间砧对苹果苗生理特性及MdPIP1-1基因表达的影响

石晓英，王 荣，姬新梅，王健强，徐继忠，张学英，周莎莎

(河北农业大学园艺学院，河北 保定 071001)

干旱是限制果树生长的主要非生物因素，对果树的产量及品质有重要影响。我国苹果栽培面积和产量均处于世界首位，大多优质苹果产区分布在降水偏少、水资源匮乏的浅山丘陵地区，加之水资源在时间和空间上的分布极不平衡，果园旱灾频发[1]。近年来，矮砧密植栽培已成为苹果生产的主流栽培模式[2]。我国应用的苹果矮化砧木主要有SH系、M系、G系等，主要利用方式为矮化中间砧[3]。因此研究矮化砧木特别是矮化中间砧对嫁接品种抗旱性的影响对于提高果树生产水平具有重要意义。

关于苹果矮化砧木的抗旱性研究报道较多[4-9]。干旱胁迫抑制了苹果砧木的光合作用，导致叶片的叶绿体超微结构受到破坏[5]。随着干旱胁迫时间的延长，植株旱害指数升高，叶片相对含水量降低，超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性先上升后下降，根系生长情况发生改变，根系活力降低[6]。植物对非生物胁迫的响应不仅表现在外部形态特征、生理生化变化等方面，其对逆境的耐受性也受多种基因表达调控和信号转导介导[10]。研究发现，质膜水通道蛋白基因PIPs可参与植株体内的水分跨膜运动，植物组织内PIPs的表达在干旱胁迫条件下发生改变[11]。目前多数研究是对矮化砧木的抗旱性进行探究[7-9]，而关于不同中间砧对嫁接品种抗旱性影响的研究较少。本试验以‘平邑甜茶’为基砧，河北省中南部广泛应用的SH40、北部常用的GM256、河北农业大学选育的矮化砧木优系黄6为中间砧，嫁接‘天红2号’红富士苹果苗为试材，进行干旱处理，研究不同中间砧对苹果苗生理特性和MdPIP1-1基因表达的影响，以期为苹果抗旱砧木的选择与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验在河北农业大学创新试验园抗旱棚进行。试验材料为盆栽苹果苗，基砧为‘平邑甜茶’，矮化中间砧分别是GM256、SH40、黄6，于2019年4月1日嫁接‘天红2号’红富士。2019年6月27日选择生长一致的试材，统一浇透水。试验共设2个处理，干旱胁迫处理(T)：浇透水后至7月6日不再浇水；对照(CK)：维持土壤相对含水量在70%～85%。采用随机区组设计，3次重复。每天调查植株生长情况，出现1级旱害开始取样，每隔1 d取样1次，7月6日大部分植株达到4级旱害，取样后复水，复水3 d后最后1次取样。取中部功能叶片用于生理指标测定，上部幼嫩叶片用于基因表达量测定。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤含水量测定 采用环刀法进行取土，取土深度为10 cm，烘干法测定土壤含水量。

土壤绝对含水量(%)=[(原土重 - 烘干土重)/烘干土重]×100%

土壤相对含水量(%)=(土壤绝对含水量/田间最大持水量)×100%

1.2.2 旱害指数测定 试验期间每天调查植株旱害情况。按照以下标准进行旱害分级：1级—叶片轻度萎蔫；2级—叶片中度萎蔫，且基部有3～5片叶发黄；3级—叶片重度萎蔫，且有1/4～1/3叶片焦枯；4级—叶片重度萎蔫，且有1/2及以上叶片焦枯[11]。

旱害指数(DI)=[∑(代表级值×本级株数)/(最高级数值×处理总株数)]×100%

1.2.4 实时荧光定量PCR分析MdPIP1-1基因表达量 苹果叶片总RNA利用天根DP441RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取，用NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪检测RNA浓度和OD值。利用反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司,北京，中国)合成cDNA，使用荧光实时定量PCR仪检测表达量，试验设置3个重复。水通道蛋白基因MdPIP1-1引物序列如表1所示。

表1 MdPIP1-1基因引物序列

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0软件对数据进行整理分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下土壤相对含水量变化

由表2可知，3种矮化中间砧苹果苗的土壤相对含水量均随着干旱胁迫时间的延长而降低。干旱胁迫第3 d时，3种中间砧苗的土壤相对含水量均降至70%以下，达到轻度干旱水平。干旱胁迫第5 d时，土壤相对含水量低于40%，达到重度干旱水平。干旱胁迫第7 d、9 d，土壤相对含水量均降至30%以下；不同中间砧苗的土壤相对含水量没有显著差异。

表2 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗的土壤相对含水量变化

2.2 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗旱害指数比较

由表3可以看出，随着干旱处理天数的增加，不同矮化中间砧苹果苗的旱害指数均呈上升趋势且存在显著差异。干旱胁迫处理第5 d时，只有GM256中间砧苹果苗出现旱害，旱害指数为13.67%。干旱胁迫处理第6～9 d时，3种中间砧苹果苗均出现了一定程度的旱害，其中黄6中间砧苗的旱害指数最低。干旱胁迫处理第9 d时，黄6的旱害指数为29.67%，而GM256中间砧苗的旱害指数高达91.67%。从旱害指数来看，黄6中间砧苗的抗旱性较强，SH40次之，GM256最弱。

表3 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗的旱害指数

2.3 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗叶片的叶绿素荧光参数

由图1可知，在干旱处理第3 d时，GM256中间砧苹果苗的Fv/Fm值显著降低，SH40、黄6中间砧苗与其对照差异不显著。干旱胁迫处理第9 d时，GM256中间砧苗的Fv/Fm值与对照相比显著下降11.47%；黄6的Fv/Fm值下降幅度最小。复水3 d后，干旱处理的3种中间砧苗的Fv/Fm值均呈现上升趋势，与正常供水对照无显著差异。

2.4 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗叶片的超氧阴离子产生速率

如表4所示，正常供水条件下，3种中间砧苗之间的超氧阴离子产生速率无显著差异。干旱胁迫下3～9 d期间，3种中间砧苗的超氧阴离子产生速率均随着干旱胁迫时间的延长而增加。干旱胁迫第3 d时，GM256中间砧苗的超氧阴离子产生速率显著高于其他中间砧苗及其对照。干旱胁迫第9 d时，GM256的增加幅度最大，与对照相比增加了1.59倍；而黄6与其对照无显著差异。复水3 d后，GM256中间砧苗的超氧阴离子产生速率分别是SH40和黄6的1.45、1.46倍。干旱胁迫期间和复水后3 d，GM256中间砧苗叶片的超氧阴离子产生速率均基本显著高于其他处理。

表4 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗叶片的超氧阴离子产生速率

2.5 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗叶片的POD、SOD活性

由图2可以看出，正常供水条件下，3种中间砧苗之间的POD活性差异不显著。干旱胁迫第3 d时，3种矮化中间砧苗的POD活性均显著高于对照。干旱胁迫第3～5 d时，黄6与SH40中间砧苗的POD活性呈上升趋势，而GM256呈下降趋势。干旱胁迫第5～9 d时，SH40、GM256中间砧苗的POD活性呈持续下降趋势，在干旱胁迫第9 d时，较对照分别降低了62.27%、69.72%。黄6中间砧苗在干旱胁迫第5～7 d下降，第7 d和第9 d时与对照差异不显著。复水后3 d，黄6与SH40中间砧苗的POD活性恢复到正常水平，而GM256的POD活性仍显著低于对照，仅为对照的46.91%。

由图3可以看出，正常供水条件下，3种中间砧苗之间的SOD活性无明显差异。干旱胁迫第3 d时，3种矮化中间砧苗的SOD活性均显著高于对照。干旱胁迫第3～5 d时，黄6中间砧苗的SOD活性呈上升趋势，在第5 d时达到峰值，干旱胁迫第5～9 d时呈下降趋势；SH40和GM256中间砧苗的SOD活性在干旱胁迫第3～9 d时，呈持续下降趋势，GM256降低幅度最大，与对照相比降低了85.78%。干旱胁迫第9 d时，SH40、黄6和GM256中间砧苹果苗的SOD活性显著低于对照，分别为对照的45.26%、63.27%和14.22%，且三者间差异显著。复水后3 d，3种中间砧苗的SOD活性均显著上升，黄6、SH40中间砧苗与对照相比无显著差异，而GM256中间砧苗仅达到对照的64.88%。

2.6 干旱胁迫下不同中间砧苹果苗的水通道蛋白基因MdPIP1-1表达量分析

由图4可知，随着干旱胁迫时间的延长，3种矮化中间砧苗叶片中MdPIP1-1基因的表达量均呈现先升高再降低的趋势，正常供水条件下的3种中间砧苗的基因表达量在各时期无显著差异。其中，SH40和GM256叶片中MdPIP1-1基因的表达量在干旱胁迫第5 d时达到最高，分别为对照的2.79、3.45倍；干旱胁迫第7 d、第9 d，相对表达量与对照无显著差异。黄6的基因表达量在干旱胁迫第7 d时达到最高，较对照升高了2.11倍；在干旱胁迫第9 d时，与对照无显著差异。

3 讨 论

优良砧木的应用需要从各方面进行综合评价。张静等[20]以PEG-6000作胁迫剂模拟室外干旱，发现M26抗旱性优于M9。但M26作中间砧，其幼龄苹果树在河北中北部易发生抽条现象，越冬能力差[21]。黄6是河北农业大学苹果课题组从八棱海棠中选出的矮化砧木优系，在本试验中作中间砧嫁接红富士表现出了较强的抗旱性，关于黄6的抗旱机理正在从基因转录水平进行研究，作为苹果矮化砧木在田间的综合表现尚需进一步的区域试验和生产试验以进行全面评价。

4 结 论

本文研究了干旱胁迫下‘天红2号/黄6/平邑甜茶’、‘天红2号/SH40/平邑甜茶’、 ‘天红2号/GM256/平邑甜茶’盆栽苹果苗的旱害指数和相关生理指标，并分析了MdPIP1-1基因在3种砧穗组合中的表达情况，得出以下结论：(1)3种中间砧苹果苗的抗旱性由强至弱依次为‘天红2号/黄6/平邑甜茶’>‘天红2号/SH40/平邑甜茶’>‘天红2号/GM256/平邑甜茶’。(2)MdPIP1-1基因响应植株干旱胁迫，其表达量峰值出现早晚与植株抗旱性强弱有关。