鼻咽癌hMLH1基因甲基化及其与临床和病理特征的关系

2021-12-08 10:55肖士东刘艳锋周详姜顺明
浙江实用医学 2021年3期
关键词:鼻咽细胞株鼻咽癌

肖士东,刘艳锋,周详,姜顺明

(建德市第一人民医院,浙江 建德 311600)

错配修复基因功能缺陷是肿瘤发生的重要因素。在其产生异变时,错配修复功能缺失,进一步影响DNA复制及合成,造成遗传的不稳定性,最终引起细胞的癌变。近年来,相关研究证实相关区域的GpG岛甲基化可能会导致肿瘤抑制基因失活[1],DNA甲基化可能影响抑癌基因和错配修复基因,具体而言就是肿瘤抑制基因和错配修复基因启动子区域CpG岛的甲基化可能阻碍启动子与转录因子的结合,从而促进肿瘤的发生和发展[2]。目前,国内暂无鼻咽癌中hMLH1基因启动子甲基化的相关研究。本文应用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)测定1个正常鼻咽上皮细胞株及20例正常鼻咽上皮组织、5个鼻咽癌细胞株及60例鼻咽癌组织hMLH1基因启动子区甲基化水平,分析hMLH1基因启动子区甲基化状态和鼻咽癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 60例鼻咽癌组织标本均为本院2012年5月-2016年5月初次确诊的患者,20例正常鼻咽上皮组织来自本院行鼻中隔矫正术患者鼻腔后上段近鼻咽部组织,另选本院1例体检健康者的外周血淋巴细胞作为阳性对照。60例鼻咽癌患者年龄 23-74 岁,平均(43.2±5.7)岁,其中男 32 例,女28例;TNM分期T1-T2期 45例,T3-T4期15例。N0期26例,N1-N3期34例;临床分期:Ⅰ-Ⅱ期24例,Ⅲ-Ⅳa期36例;病理分型:低分化鳞癌43例,未分化癌17例。5个鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、TWO2、HNE1、HONE1)全部购于上海雅吉生物有限公司,正常鼻咽上皮细胞株NP69购于上海泽叶生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学预测 在线使用NCBI检测hMLH1在基因组的位置,METH-PRIMER软件分析hMLH1启动子区有无典型CpG岛,同时在线设计MSP及BSP特异性引物。

1.2.2 DNA及RNA的提取 (1)提取组织细胞DNA:使用蛋白酶K消化,再使用酚/氯仿抽提,最后使用乙醇沉淀方法提取DNA。(2)提取组织及细胞RNA:制备组织匀浆和细胞,加入0.2mL氯仿,12000r/min离心5分钟,离心后将上层水相移入新管中,加入0.5mL异丙醇12000r/min离心10分钟,将EP管中的上清液倒出,加入1mL乙醇混匀,8000r/min离心5分钟,每个EP管中加入30μL的DEPC水,放入55℃~60℃水浴锅中水浴10分钟,水浴完毕后取出RNA。

1.2.3 hMLH1的表达 qRT-PCR检测细胞及组织中提取后的RNA hMLH1的相对表达。在冰块上行逆转录。混匀相关试剂后在PCR仪上65℃加热5分钟,取出置冰上。往冷却后的MIX中加入配置的逆转录反应液,配成总体积20μL,置PCR仪上42℃加热60分钟,95℃ 5分钟,4℃ 10分钟,取出-20℃保存。制定定量PCR反应MIX,引物由上海生物工程技术服务有限公司设计合成,使用BIORED荧光定量PCR仪器,反应程序95℃3分钟预变性;95℃12秒,62℃40秒,共40个循环。结果使用2-△△Ct计算其相对表达量。

1.2.4 外周血DNA的CpG甲基化酶修饰 1μg DNA加入2μL 10×反应缓冲液,1单位的CpG甲基化酶和0.1μL 200×S-腺苷甲硫氨酸,RP管中加DEPC水至20μL,在37℃温育1个小时,再进行下一步DNA的亚硫酸氢盐修饰,用于阳性对照。

1.2.5 DNA的亚硫酸氢盐修饰 亚硫酸氢盐修饰鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织、鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞株,以及外周血淋巴细胞中提取的DNA及使用CpG甲基化酶处理过的DNA。外周血淋巴细胞中提取的DNA经亚硫酸氢盐修饰后用于非甲基化阳性对照模板。BSP引物F:5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTA-3',R 5'-CCCAAAAAAAACAAAATAAAAATC-3'。PCR反应后,琼脂糖凝胶电泳观察结果,回收PCR产物,将PCR纯化产物连接到pUC18-T载体,连接产物转化,蓝白斑筛选,质粒提取后测序。

1.2.6 甲基化特异性PCR hMLH1基因甲基化和非甲基化引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。甲基化引物F:5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTAC-3',R 5'-ACTAAACACGAATACTACGAACGAT-3';非甲基化引物F:5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTAT-3',5'-ACTAAACACAAATACTACAAACAAT-3',甲基化特异性PCR程序:95℃ 3分钟, 使用 94℃ 30秒、60℃ 20秒、72℃ 20秒,共37个循环,延伸72℃5分钟。非甲基化特异性PCR程序:引物95℃3分钟,使用94℃30秒、58℃ 20秒、72℃ 20秒,共 37个循环,延伸 72℃ 5分钟。再使用2%的琼脂糖凝胶电泳分析。正常外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化阳性对照,CpG甲基化酶修饰后正常外周血淋巴细胞DNA模板作为甲基化阳性对照,水作为空白对照。

1.2.7 5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-dC)处理细胞株 当细胞长满细胞瓶70%时候,用5μM 5-Aza-dC处理鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞株72小时,每隔24小时换液1次。处理后的细胞进行相关细胞学实验。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件处理数据,计量资料采用(±s)表示,并采用 t检验;甲基化阳性率及其与临床病理参数的差异采用χ2检验或Fisher's精确检验。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测 hMLH1基因表达水平hMLH1在5个鼻咽癌细胞株中的相对表达量较在1个正常鼻咽上皮细胞株中明显少(图1),hMLH1在鼻咽癌组织中的相对表达量较正常鼻咽上皮组织中明显少,差异有统计学意义(P<0.01)(图 2)。去甲基化药物5-Aza-dC处理鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞株后hMLH1的表达量与正常鼻咽上皮细胞株相比不再明显降低(图3)。

图1 hMLH1在5个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株的相对表达量

图2 鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织中的hMLH1基因表达水平

图3 5-Aza-dC处理细胞株后hMLH1在鼻咽癌细胞株和正常鼻咽上皮细胞株中的相对表达量

2.2 hMLH1基因启动子区域甲基化分析 采用NCBI检测 hMLH1在基因组位置(图 3),hMLH1位于人3号染色体上,具体位置:NC_000003.12(36993487.37050846)。METH-PRIMER 软件分析hMLH1启动子区(hMLH1第一外显子前约2000bP)有无典型CpG岛。同时在线设计MSP及BSP特异性引物(图 4-5)。

图4 hMLH1在基因组中的位置

图5 hMLH1启动子区存在典型的CpG岛及MSP引物设计

2.3 hMLH1基因的甲基化状态 正常鼻咽上皮细胞株及20例正常鼻咽上皮组织中均未检测到hMLH1基因甲基化;而在5个鼻咽癌细胞株中有4例(80.0%)有hMLH1甲基化现象,60例鼻咽癌组织中有26例(43.3%)有hMLH1甲基化现象,两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)(图6)。使用亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)检测5个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株中hMLH1基因的甲基化状态,每株细胞3个克隆。发现在5个鼻咽癌细胞株中有4个鼻咽癌细胞株表现为启动子区CpG岛高甲基化,1个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株未甲基化(图7)。结果与甲基化特异性 PCR(MSP)一致。

图6 hMLH1启动子区存在典型的CpG岛及BSP引物设计

图7 MSP检测hMLH1基因的甲基化状态

PCR扩增产物电泳可以出现以下三种情况,使用甲基化引物扩增出目的条带,而非甲基化引物的扩增产物未出现条带,这种情况为甲基化;非甲基化特异性引物扩增出条带,而甲基化引物的扩增产物未出现条带,即为未甲基化;如果甲基化和非甲基化引物都扩增出条带,这种情况为半甲基化或者部分甲基化。M使用甲基化引物;U:使用非甲基化引物;MSP:甲基化特异性 PCR;CNE1、CNE2、TWO2、HNE1、HONE1为鼻咽癌细胞株;NP69:正常鼻咽上皮细胞株;T1-4:鼻咽癌组织;N1-2:正常鼻咽上皮组织。 结果提示:CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、T1、T2、T4为甲基化标本;TWO3、NP69、T3、N1、N2为非甲基化标本。详见图8。

图8 5个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株甲基化情况及位点

2.4 hMLH1基因甲基化与临床和病理特征的关系鼻咽癌中hMLH1基因甲基化与hMLH1基因非甲基化患者间临床病理特征差异无统计学意义(P>0.05)。详见表 1。

表1 鼻咽癌hMLH1基因甲基化与临床和病理特征的关系

3 讨论

鼻咽癌与多种基因突变和表观遗传畸变有关[3]。研究表明,启动子CpG岛上的异常DNA甲基化是鼻咽癌发展和进展的基础。此外,越来越多的证据表明,许多基因主要被鼻咽癌上皮细胞的DNA甲基化所沉默[4-5]。鉴别差异DNA甲基化基因有助于了解发病机制,开发可用的生物学标志物,早期诊断鼻咽癌同时优化和个性化治疗鼻咽癌。据报道[6],在鼻咽癌组织和细胞中,DACT1基因的表达与甲基化状态有关,通过调节甲基化状态和调节肿瘤细胞的生长和侵袭来改变甲基化状态。相关研究报道[7-10],在散发性大肠癌、头颈恶性肿瘤、胃癌等多种肿瘤中均存在错配修复系统的异常,其中以hMLH1基因的启动子区甲基化最常见。近年来,陆续有关于鼻咽癌中微卫星不稳定的研究报道表明鼻咽癌存在错配修复系统的异常,但是否也存在“hMLH1基因启动子区异常甲基化”目前为止国内尚未报道。本研究通过检测hMLH1基因的表达及其启动子区甲基化呈现的状态探讨hMLH1基因同鼻咽癌临床病理特征之间的关系,旨在找出可能作为鼻咽癌早期分子生物学诊断的标志物。

研究结果提示,正常鼻咽上皮细胞株及20例正常鼻咽上皮组织中均未检测到hMLH1基因甲基化,而在5个鼻咽癌细胞株中hMLH1甲基化频率为80.0%(4/5),60例鼻咽癌组织中hMLH1甲基化频率为43.3%(26/60),两者与正常对照比较差异均有统计学意义(P<0.01),表明hMLH1基因启动子区甲基化只发生在鼻咽癌组织和细胞株中,具有高度的肿瘤特异性,进一步分析还发现其甲基化状态与临床和病理特征之间均无明显相关性(P>0.05),提示甲基化状态为鼻咽癌早期事件。使用亚硫酸氢盐修饰后测序(BSP)检测5个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株 (每株细胞3个克隆)中hMLH1基因的甲基化状态,发现5个鼻咽癌细胞株中有4个鼻咽癌细胞株表现为启动子区CpG岛高甲基化,1个鼻咽癌细胞株和1个正常鼻咽上皮细胞株未甲基化,结果与MSP一致。鼻咽癌细胞及组织中hMLH1其启动子区域甲基化程度较高,而正常鼻咽上皮细胞株及组织中未检出hMLH1其启动子区域甲基化,说明鼻咽癌的发生可能和hMLH1启动子区域甲基化程度有关。但是,作者也发现极少数鼻咽癌细胞株及组织hMLH1启动子区域甲基化程度较低,甚至未出现甲基化,这一现象是否与“肿瘤病理种类、分级以及个体差异”有关有待进一步研究。随后使用去甲基化药物5-Aza-dC处理鼻咽癌细胞株,正常鼻咽上皮细胞株后再次检测hMLH1的表达量发现鼻咽癌细胞株中hMLH1的表达量与正常鼻咽上皮细胞株相比不再明显降低,说明hMLH1的表达量可能受其启动子区域甲基化程度所调控。

另外,本研究结果还表明,甲基化状态与年龄、性别、临床分期、病理类型等均无明显关系,与Wong等[11]报道符合。

hMLH1在鼻咽癌肿瘤组织及细胞中低表达,有抑癌作用,hMLH1的表达量可能受其启动子区域甲基化程度所调控。临床上用甲基化药物重新激活其表达可以抑制鼻咽癌的癌变,具有潜在的基因治疗价值。

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