13C脉冲标记法研究非正常凋落物对土壤有机碳的激发效应

张天霖，蔡章林，赵厚本*，吴仲民，周光益，邱治军

1. 中国林业科学研究院热带林业研究所，广东 广州 510520；2. 南岭北江源森林生态系统国家定位观测研究站，广东 广州 510520

近些年来，由于人类活动引起的全球气候变化对森林、草原、海洋等不同生态系统的结构和功能造成了深远的影响（Scholze et al.，2009；Okey et al.，2014）。全球气候变化导致的台风、冰雹、极端降水等极端气候事件已经成为森林生态系统失衡的主要因素之一（刘世荣等，2014）。极端气候事件往往对森林造成机械损伤，产生诸多新鲜的落叶、断枝、断干等，这种由于外力作用而产生的植物新鲜残体被定义为“非正常凋落物”（吴仲民等，2008）。非正常凋落物具有瞬时大量产生的特点，如吴仲民等（1994）发现尖峰岭热带山地雨林原始林的非正常凋落物高达4.7 Mg·hm−2，占全年凋落物总量的43%。Lodge et al.（1991）发现波多黎各台风影响产生的凋落物输入量为 10.06—10.83 Mg·hm−2。骆土寿等（2008）调查显示2008年特大冰灾所造成的非正常凋落物量高达 13.96—19.59 Mg·hm−2。非正常凋落物的物理和化学性质均和正常凋落物有较大差异，如台风产生的凋落物中的氮和磷含量分别为正常凋落物的13倍和1.5—2.4倍（Lodge et al.，1991）。还有学者从非正常凋落物的碳储量（许涵等，2008）、养分归还（陈耀德等，2006）以及对土壤的影响（肖以华等，2013）等方面开展了相应的研究。

土壤碳库是地球陆地生态系统最大的碳库，土壤有机碳（SOC）储量是地上植被碳库的3倍，是大气碳库的两倍（Jobbagy et al.，2000）。森林土壤碳库更是至关重要的碳储库和碳汇（刘世荣等，2011）。因此，土壤有机碳的微小变化都将对全球碳循环产生显著的影响（Smith et al.，2008）。凋落物的输入与土壤有机质的分解是全球碳循环的重要组成部分（Guenetet al.，2018），维持着土壤碳库的平衡（Trumboreet al.，2008）。外源有机质的输入将在短时期内改变土壤原有有机碳的矿化过程，这种现象被称为土壤碳激发效应，正向的土壤碳激发效应将加速SOC的分解，负向则会产生抑制作用（Zhanget al.，2012）。在极端气候事件的影响下，非正常凋落物的大量输入可能打破土壤碳库的平衡，从而造成深远的影响。有研究指出，凋落物输入增加改变了土壤微生物的周转，将导致土壤排放更多的 CO2，进一步加剧全球变暖（Sayer et al.，2011）。目前，国内外学者已经针对土壤碳激发效应开展了诸多研究，这些研究主要集中于不同外源添加物对土壤的碳激发效应方向和强度（Fontaine et al.，2007；Zhang et al.，2012）、环境因子对碳激发效应的影响（Lenka et al.，2019）、土壤微生物响应过程（Li et al.，2018）等方面。

全球气候变化影响下，极端气候事件干扰将逐渐增强（Fischer，2019），由于极端气候事件所产生的非正常凋落物可能成为未来全球变化对森林生态系统影响的重要方面。然而，关于非正常凋落物的分解过程及对土壤碳库的影响研究十分匮乏，其在生态系统中的作用还有待深入研究。南亚热带森林结构复杂，在陆地土壤碳库和全球碳循环中扮演重要角色（Yu et al.，2014；Xu et al.，2018），且容易受到台风、冰暴等极端气候事件的干扰。因此，探究非正常凋落物的分解过程及其对南亚热带森林土壤碳库的影响具有明显的现实意义。本文选取了马尾松（Pinus massoniana）、黧蒴锥（Castanopsis fissa）、浙江润楠（Machilus chekiangensis）3种南亚热带森林主要树种，利用脉冲标记法对植物叶片进行13C标记，开展室内控制实验模拟了极端气候事件影响下的非正常凋落物输入对土壤的影响，旨在探究不同树种的非正常凋落物的分解过程及其土壤碳激发效应，以期揭示南亚热带森林生态系统对极端气候事件干扰的响应，为全球变化下南亚热带森林生态系统管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

研究地点位于广东省韶关市小坑林场（24°42′28.07′′N，113°50′10.08′′E），海拔为 244—256 m。研究区域属南亚热带季风气候区，冬季盛行东北季风，夏季盛行西南和东南风。年均气温为20.3 ℃，年均太阳辐射467.52 kJ·m−2，年平均降雨量为1530 mm。土壤类型主要为花岗岩发育而成的红壤，富含有机质。研究样地选在50—60年生的针阔混交林，优势树种主要包括马尾松、浙江润楠、黧蒴锥、米锥（Castanopsis chinensis）、木荷（Schima superba）等。2008年该区域曾遭受特大冰雪灾害影响，具有一定的代表性。

1.2 植物材料准备

参考之前相关研究采用脉冲标记法对植物材料进行13C标定（Bromand et al.，2001；Lu et al.，2003）。具体方法为：用 PVC管搭建 2个 4 m×2 m×1.8 m的框架，之后用透光率95%的聚乙烯膜密封。在密封箱内安装风扇、温度计、补光灯等。选取马尾松、黧蒴锥、浙江润楠幼苗各50株，保证幼苗均高约为1 m，生长状况良好。将植物幼苗放入密封箱培养10 d以适应密封箱环境。标定开始前，先对密封箱进行2 h的遮黑处理。将4个装有15 g Na213CO3和过量柠檬酸、2个装有15 g Na212CO3和过量柠檬酸的烧杯放入箱内，之后密封。标定开始时，从箱外用注射器先向装有Na213CO3的烧杯内注水，催化反应产生13CO2。2小时后，向装有Na212CO3的烧杯注水，进一步提升箱内CO2浓度，促进植物光合作用。每隔1天标定一次，共标记3次，标定时间分别为2020年7月19日、7月21日、7月23日的09:00—11:00，之后在密封箱中继续培养30 d。标定完成后，采集植株上所有新鲜叶片（非正常凋落物）供分解培养使用。

1.3 土壤材料准备

土壤材料来源于小坑林场的南亚热带次生针阔混交林。在林内随机选择取样点，移除地表凋落物后分别取0—5、5—10、10—20 cm 3层土壤，捡出肉眼可见的植物残体、根系、石块等杂物，粉碎其中较大的土块并过2 mm筛，之后将同层土壤充分混合，带回实验室供培养使用。

1.4 实验设计

准备12个直径为20 cm，高为45 cm的PVC培养桶。培养桶底部有直径3 mm的小孔，保证培养装置的透水性和透气性。将取回的土壤样品按10—20、5—10、0—5 cm的顺序依次放入培养桶内，保持土壤密度与样地自然状态下基本一致。将土壤填回后于室内静置 20 d，使土壤恢复至自然状态。

实验共设置3个处理组，分别为培养桶土壤表面添加马尾松、黧蒴锥和浙江润楠的新鲜叶片。以不向培养桶添加任何叶片作为对照组。处理组和对照组各重复3次。标记好的新鲜植物叶片样品采摘下来后，立即均匀地平铺在培养桶内土壤表层，植物叶片碳氮含量详见表1。每桶叶片量参考2008年特大冰雪灾害所产生的非正常凋落叶量，换算为干重为25 g。培养桶整体称重后放置在温室内培养，培养开始后每3天称重1次并用去离子水补充蒸发水分控制土壤含水率在25%，维持室内温度在25—29 ℃，空气湿度在60%左右。培养结束后，分层采集桶内土壤以及剩余的非正常凋落物，分析其理化性质。

表1 13C标记植物叶片特征Table 1 Characteristics of the 13C-labeled plant leaves

1.5 CO2采集及计算

气体于培养开始后第0、1、3、5、7、10、15、20、25、35、45、55、70、90、110天采集，采集时间选取在当天 09:00—12:00。气体采集方法为：将直径27.5 cm，高35 cm的培养桶盖覆于培养桶之上，桶盖内装有电扇，保证气体充分混合。盖上培养桶盖30 s后用注射器抽出300 mL培养桶盖内气体并装入气体采样袋中，之后每隔 10 min采集一次，共采集4次。采集的气体利用Picarro G2201-i分析仪（美国）分析其CO2浓度以及13C同位素值（δ13C）。

参考Wang et al.（2014）的方法，利用同位素混合模型区分CO2来源：

式中：

Qt——培养桶产生的总CO2量；

δt——总CO2的13C同位素值；

Qs——来源于土壤中的CO2量；

δb——对照组产生的CO2的13C同位素值；

Qd——来源于非正常凋落物的CO2的量；

δd——非正常凋落物的初始13C同位素值。

碳排放计算公式：

式中：

F——CO2排放速率；

V——培养桶盖中的气体体积；

S——培养桶底面积；

ρ——标准状态下CO2的密度；

P——采样地点的大气压值；

P0——标准状态下的大气压值；

T——采样时的绝对温度；

T0——标准状态下的绝对温度；

dQ1/dt——采样时气体浓度随时间变化的线性回归斜率。

碳激发效应计算公式：

式中：

PE——碳激发效应强度；

Fs——来源于土壤中的CO2的排放速率；

Fb——对照组产生的CO2的排放速率。

CO2累积排放量计算公式：

式中：

Et——CO2累积排放量；

Fn——第n天的碳排放速率；

Fm——第m天的碳排放速率；

Dn——第n天；

Dm——第m天；

S——培养桶底面积；

h——每天的小时数。

1.6 土壤化学分析

培养实验前的土壤样品与培养实验结束后采集的土壤样品进行风干处理，粉碎过筛后进行化学分析。有机碳采用重铬酸钾外加热法测定，全氮采用半微量凯氏定氮法测定，有效氮采用碱解扩散法测定（刘光崧，1996），13C同位素丰度值（δ13C）采用Picarro G2201-i分析仪（美国）进行测定。

1.7 统计分析

采用SPSS 23.0进行所有数据分析工作，采用Origin 2018进行绘图。采用单因素方差分析法（oneway ANOVA）对非正常凋落物的碳排放速率、碳激发效应强度以及不同处理组和不同土层的土壤化学性质进行差异性检验，利用多因素方差分析（multi-factor ANOVA）对不同处理组和不同土层交互作用下的土壤化学性质进行差异性检验，用最小显著差数法（LSD）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 非正常凋落物碳排放过程

如图1所示，非正常凋落物的碳排放过程主要分为4个阶段：培养初期（0—7 d），非正常凋落物碳排放速率快速升高，在短时间内达到峰值，上升速度表现为黧蒴锥>浙江润楠>马尾松；之后一段时间（7—15 d），碳排放速率呈波动下降，碳排放速率表现为黧蒴锥>浙江润楠>马尾松；培养中期（15—45 d）碳排放速率持续下降，下降速度表现为黧蒴锥>马尾松>浙江润楠；培养后期（45—110 d），碳排放将稳定在较低水平，且3种树种的非正常凋落物之间差异较小。马尾松、黧蒴锥、浙江润楠的非正常凋落物碳排放速率峰值分别为156.02、323.08、300.57 mg·m−2·h−1，前 3 个阶段（0—45 d）的碳排放量分别占其总排放量的91.39%、93.17%、94.04%。培养过程中马尾松、黧蒴锥、浙江润楠的非正常凋落物碳分解量分别为5.80、7.13、5.58 g，占其总分解碳量的67.86%、95.31%、92.41%。

图1 不同种非正常凋落物的碳排放动态Fig. 1 The dynamics of total CO2 flux of different abnormal litters

2.2 非正常凋落物对土壤的碳激发效应

如图2所示，马尾松、黧蒴锥、浙江润楠3组处理对土壤的碳激发效应过程主要分为3个阶段：快速增加阶段（0—7 d），非正常凋落物输入迅速产生强烈的负激发效应，并在7 d左右达到峰值，激发效应强度峰值分别为−50.05、−117.72、−124.08；减弱阶段（7—35 d），这一阶段中负激发效应逐渐减弱，表现为前期减弱迅速之后逐渐转慢；平稳阶段（35—110 d），整体表现较平稳，不同处理之间有所差异：黧蒴锥和浙江润楠的负激发效应逐渐降低，而后转为正激发效应，正激发效应强度分别于45—55 d达到峰值，峰值分别为20.43和20.26，之后激发效应缓慢降低至消失。马尾松维持较低强度的负激发效应至约90 d，之后缓慢下降消失。

图2 不同非正常凋落物的土壤碳激发效应强度Fig. 2 The priming effects intensity of different abnormal litters

2.3 土壤有机碳

如表2所示，110 d培养后，马尾松、黧蒴锥处理组的 0—5 cm土壤 OC含量显著高于对照组（P<0.05），黧蒴锥的0—5、5—10 cm土壤的δ13C显著高于对照组（P<0.05）。各处理组与对照组之间全氮（TN）、有效氮（AN）差异均不显著（P>0.05）。不同土壤深度之间的OC、TN、AN、δ13C呈极显著差异（P<0.01）。土壤深度和不同处理的双因素影响下，土壤OC呈显著差异（P<0.05），而TN、AN、δ13C差异不显著（P>0.05）。

表2 不同处理组培养前后土壤养分含量Table 2 Soil nutrient content before and after incubation in different treatments groups

3 讨论

本研究中，3种非正常凋落物的碳排放速率均表现为前期快速升高，中后期逐步降低并维持在较低水平。整个培养过程中，非正常凋落物中的碳大量消耗，其中 91.39%—94.04%的碳在 0—45 d消耗，这表明非正常凋落物在较短时间内完成了大部分分解。与正常凋落物的分解过程相比（郭培培等，2009），非正常凋落物前期分解速率较高，变化更加剧烈。之前也有研究表明非正常凋落物分解速率快于正常凋落物，如Xu（2006）研究发现，台风造成的新鲜凋落物整体分解速率高于普通凋落物，与本研究结果相一致。不同种非正常凋落物的分解过程有所差异，其中黧蒴锥分解启动最快，也是最早开始下降的，表明该种最容易分解；浙江润楠在培养前期维持了长时间的高速率分解，表明该种易分解组分所占比例较高；马尾松分解启动最慢，且最高分解速率较低，但是下降时间较晚，表明该种最难分解。不同种非正常凋落物成分组成差异可能是造成分解过程差异的主要原因，黧蒴锥、浙江润楠等阔叶树种中含有更多的单糖等易分解碳且氮、磷等养分含量较高，而马尾松等针叶树种含有更多的木质素等不易分解碳且养分含量较低（郭培培等，2009）。

微生物对碳的需求是诱发碳激发效应的主要原因（Wang et al.，2015）。本研究中，非正常凋落物输入土壤后，在早期抑制SOC分解，引起强烈的负激发效应。之前的研究也得到过类似的结果（Guenet et al.，2010），这可能源于微生物的底物优先利用。底物优先利用假说认为，当外源新鲜有机碳进入土壤中后，比起土壤原有的有机质，微生物更倾向于利用新加入的易分解的碳（Cheng，1999），这一过程往往由善于利用易分解碳的r型微生物主导。研究表明，葡萄糖、蔗糖等易分解的外源添加物往往导致负向的激发效应（Kuzyakov et al.，2000）。易分解碳组分更容易被微生物利用，其输入引发的激发效应更加强烈，尤其是在激发效应初期（Blagodatskaya et al.，2008）。正常凋落叶在凋落之前养分大部分转移到了植物其他器官，而由于外力作用而产生的非正常凋落叶中含有大量的水分、易分解碳以及氮、磷等营养元素（Lodge et al.，1991），促使微生物在培养初期大量增殖，生物量急剧增加，促进了非正常凋落物的快速分解，并对土壤有机碳库产生强烈的负激发效应。

随着培养的进行，不同树种非正常凋落物的碳激发效应表现出不同的变化趋势。黧蒴锥和浙江润楠对土壤的负激发效应强烈而短暂，在培养开始后约35 d，逐渐转向低强度的正激发效应，并持续至约70 d。这可能是由于非正常凋落物中易分解的养分大量消耗之后，剩余养分不足以满足土壤微生物群落的养分需求，迫使其转向利用土壤原有有机质以满足自身生长需求，这往往导致在培养后期的碳激发效应由负向转为正向。Moorhead et al.（2006）研究表明，当外源添加物中的氮元素不足以满足微生物生长需求时，微生物将加速分解土壤原有有机质以获得更多的氮元素。不同于黧蒴锥和浙江润楠，马尾松组的负激发效应在早期强度较低但持续时间较长，且不会转为正向而是逐渐消失。这种差异可能源于不同添加物的化学组分及养分含量不同。有研究表明，添加物的化学组份不同可能对碳激发效应产生较大影响（Aerts，1997）。相较于易分解组分含量较高的阔叶树种，微生物群落对马尾松等不易分解组分含量较高的针叶树种叶片的利用效率较低，限制了碳激发作用的强度。同时，马尾松的非正常凋落物中较低的氮元素含量以及较高的C꞉N（Wang et al.，2015），也可能是造成这种差异的原因。

一般认为，凋落物和植物根系是土壤有机碳的主要来源（王清奎，2011）。然而，越来越多的研究表明，土壤有机碳主要来源于细根周转以及真菌（Clemmensen et al.，2013；Treseder et al.，2013）。培养过程中，马尾松、黧蒴锥和浙江润楠的非正常凋落物分解释放的碳有 67.86%—95.31%排放到了大气当中，表明非正常凋落物的产生显著促进了森林生态系统碳排放。Yu et al.（2020）的研究表明，新鲜植物残体分解产生的碳 77.16%—87.90%进入了大气中，与本实验结果基本一致。110 d后表层土壤有机碳和δ13C有所增加，但是深层的土壤有机碳和δ13C均没有显著变化。表层土壤有机碳含量及δ13C的增加可能源于非正常凋落物中小部分碳分解进入土壤，也可能由于土壤动物的作用下使凋落物碎屑进入了土壤表层（徐璇等，2019）。整体而言，非正常凋落物输入对土壤有机碳库的影响较小，而对于碳排放的促进作用较大。这可能源于非正常凋落物养分充足，微生物从土壤中转移并大量聚集在凋落物层，大部分凋落物中的碳不进入土壤碳库而直接以CO2的形式释放到大气当中。而对于土壤碳库而言，凋落物中的碳不足以对深层土壤产生影响。同时，土壤碳库的形成是一个长期的过程，短期的非正常凋落物输入对土壤碳库的影响在数月或数年的观测中难以察觉（Trumbore et al.，2008）。

无论如何，在极端气候事件的影响下，非正常凋落物的大量输入将使地表植被的碳大量释放到大气当中。非正常凋落物进入土壤的碳可能是土壤碳库中的快速周转部分，土壤表层碳的增加可能只是短期效应，而非正常凋落物添加对土壤碳库的长期影响仍未明确。本研究着重探讨了不同碳氮比的非正常凋落物的分解过程及对土壤的碳激发效应，之后将进一步探究非正常凋落物其他化学特征诸如磷含量、木质素含量、水分等的影响。同时，在现实情况下，南亚热带林森林受到干扰所产生的非正常凋落物往往是多树种的混合，本研究只模拟了不同树种非正常凋落物独立作用下的分解及对土壤的碳激发效应，针对多树种非正常凋落物混合作用下的分解及对土壤的碳激发效应仍需进一步研究。

4 结论

非正常凋落物碳排放过程主要表现为前期速率快速升高，之后速率逐渐降低，后期稳定在较低水平，其中91.39%—94.04%的碳在前中期（0—45 d）分解释放，这表明非正常凋落物在较短时间内完成了大部分分解。不同树种非正常凋落物添加均会在前期引起土壤碳强烈的负激发效应。随着培养的进行，不同树种碳激发效应略有差异。黧蒴锥和浙江润楠的非正常凋落物输入土壤后迅速产生强烈且短暂的负激发效应，之后逐渐转为强度较低的正激发效应。马尾松的非正常凋落物产生的负激发效应强度低于黧蒴锥和浙江润楠但持续时间较长，之后逐渐降低至消失。经过110 d的培养，表层土壤有机碳、13C同位素值有所增加，而深层土壤没有显著变化。各处理组不同土层的全氮、有效氮均没有显著差异。整个培养过程中，非正常凋落物中的碳大部分分解释放到大气当中。在全球气候变化的背景下，频发的极端气候事件将干扰森林生态系统并产生更多的非正常凋落物，导致大量CO2释放到大气当中，这将对全球气候变化以及南亚热带森林生态系统管理产生深刻影响。