辣椒碱对泌乳前期奶牛产奶性能、血清生化指标、瘤胃微生物及代谢组的影响

朱 靖 林 红 裴明财 韩兆玉

(南京农业大学动物科技学院乳牛科学研究所，南京 210095)

奶牛分娩后因泌乳需要，对营养需求较高,但此时干物质采食量较低，无法满足泌乳需求，往往导致奶牛机体发生能量负平衡[1]。干物质采食量是维持泌乳前期高产基础，能量供给不足导致奶牛不能达到理想的产奶高峰，高峰期缩短，致使整个泌乳期产奶量大幅度降低[2]。此外，为了满足产奶的能量需要，奶牛必须分解自身贮存的脂肪，产生大量酮体，易发生酮病，影响产奶量、乳成分及奶牛健康[3]。为了解决能量负平衡这一难题，许多研究者提议提高奶牛饲粮中精料比例，从而满足奶牛的营养需要。但精料比例过高会导致瘤胃pH降低，瘤胃长期处于高酸环境中，导致奶牛易患蹄叶炎、脂肪肝等疾病[4]，且高精料饲粮会导致奶牛采食量下降，并不一定能够促进奶牛能量摄入。因此，在适度提高泌乳前期奶牛饲粮精料比例基础上，还需寻找提高奶牛干物质采食量的方法。瘤胃中的微生物能够降解营养物质，产生挥发性脂肪酸，并合成微生物蛋白质，分别是反刍动物的能量和蛋白质主要供应来源[5]。然而，由于甲烷损失和氨态氮流失，这种发酵过程的能量和蛋白质产生效率是比较低的，可能会限制生产性能，并导致污染物释放到环境中。抗生素离子载体在减少瘤胃中的能量和蛋白质损失方面非常成功，但是抗生素在动物饲粮中的使用正面临着社会质疑，世界各国逐渐禁止抗生素作为添加剂饲喂动物[6-8]。为此，科学家们不断探索其他控制特定微生物种群以调节瘤胃发酵的替代方法。有研究结果表明，辣椒碱可以增加丙酸盐的产生，减少乙酸盐或甲烷的产生，并改变瘤胃中的蛋白质水解、肽解或脱氨作用[9]。因此，本试验选择辣椒碱添加到泌乳前期奶牛饲粮中，探究其对奶牛产奶性能、血清生化指标、瘤胃微生物及代谢组学的影响，期望能够为辣椒碱在泌乳前期奶牛生产上的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验采用微囊包被的天然辣椒碱作为试验材料，由广州某生物科技股份有限公司提供，有效成分含量为2%，其余成分为石粉、沸石粉等载体。

1.2 试验设计

试验选取(2.9±0.9)岁、胎次(1.9±0.9)胎和产奶量(35.57±2.57)kg的40头泌乳前期奶牛，随机分为对照组和试验组，每组分为5个重复，每个重复4头牛。试验地为某乳液公司奶牛场，试验时间在2020年10—11月份。对照组饲喂原奶牛场饲粮，试验组在原奶牛场饲粮基础上每头添加1.2 g/d辣椒碱(生产方建议添加量)，用少量玉米粉混合后均匀地分成3份，分别于每日04:00、12:30、19:00均匀地撒在奶牛饲粮上。保证自由饮水，定期对牛舍消毒，打扫卫生。预试期7 d，正试期2个月。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 干物质采食量、产奶量及乳成分的测定

试验期间，采用全自动配料机配料，每天记录总投料量，每天早上分别清理2组试验牛剩料并称重记录，测定干物质含量，计算试验牛干物质采食量。试验第1、15、30、45、60天时，分别记录产奶量并采集奶样，测定乳成分，用装有防腐剂的50 mL离心管，按奶样早∶中∶晚=4∶3∶3收集并混合均匀，冰袋保存迅速带回南京农业大学乳品检测中心，使用全自动乳成分分析仪(MilkoScan-FT120)进行检测，测定指标有乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、总固形物含量、体细胞数和尿素氮含量。4%标准乳(FCM)含量计算公式如下：

4%标准乳=M×(0.4+0.15F)。

式中：M为产奶量；F为乳脂率。

1.4 血清生化指标的测定

在试验第1、60天时，分别尾静脉采血10 mL，分离血清，-80 ℃保存待测。测定血清生化指标包括：葡萄糖(glucose,GLU)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性，以上指标由酶标仪(RT-6000)测得，试剂盒来源为南京建成生物工程研究所；血清皮质醇(cortisol,COR)、多巴胺(dopamine,DA)含量及磷酸肌酸激酶(phosphocreatine kinase,CPK)活性由江苏酶免实业有限公司检测，测定仪器为全自动放免仪(Sn-69513)，使用试剂盒为放射免疫试剂盒，由江苏酶免实业有限公司生产。

1.5 试验牛瘤胃液的采集与测定

在试验第60天，每个重复中随机挑选1头试验牛以备采集瘤胃液，每组5头，共计10头。采样前，提前3～4 h让试验牛禁食以便采集瘤胃液，采样方法为瘤胃口腔导管法。先用牛颈夹将试验牛固定，再用牛鼻钳夹住牛鼻中隔拉向正前方使牛头和颈部伸直；然后将特制的、清洗干净的瘤胃口腔导管沿牛舌方向缓慢插入，经食管抵达瘤胃腹囊内；用250 mL的大号采集器抽气直到瘤胃液流出，待瘤胃液均匀度一致后即可采样。采样完毕，将导管体外端密封后再将采样管缓慢抽出，将瘤胃口腔导管用清水彻底清洗后方可用于下一头试验牛瘤胃液样品的采集。注意保证每头奶牛瘤胃液采集部位相同，避免由于瘤胃不同位置的微生物差异对试验结果造成影响，同时为了减少人为误差，所有试验牛瘤胃液的采集均由同一名技术娴熟的兽医专门负责。每头试验牛采集200 mL瘤胃液，4层纱布过滤后，测定pH，留存100 mL分装到每个测定指标的离心管中待后续测定挥发性脂肪酸、氨态氮、微生物蛋白含量，其中测定细菌的瘤胃液分装在5 mL的冻存管，投入液氮罐中速冻，并送往南京奥青生物有限公司测定微生物区系及代谢组。

1.6 数据统计分析

试验所得数据由Excel 2016初步处理后用SPSS 20.0的一般线性模型(GLM)进行双因素方差分析(two-way ANOVA)，然后各组间进行最小显著差数法(LSD)多重比较，所有数据结果用平均值±标准误表示。P<0.05为差异显著，生长性能及血清生化指标含40个样本，瘤胃发酵参数、微生物区系及代谢组含10个样本。

2 结果与分析

2.1 辣椒碱对泌乳前期奶牛干物质采食量、产奶量及乳成分的影响

由表2可知，与对照组相比，在试验第15、30、45、60天，试验组产奶量显著上升(P<0.05)，但4%标准乳含量仅在试验第60天后有显著升高(P<0.05)，其他时间均无显著性差异(P>0.05)。在试验第30、45天时，对照组乳脂率显著高于试验组(P<0.05)，在同一时间，干物质采食量、乳糖率、乳蛋白率及总固形物、乳尿素氮含量无显著变化(P>0.05)。与对照组相比，在试验第1、30、45天，试验组乳体细胞数显著提高(P<0.05)，而试验第60天，试验组乳体细胞数显著降低(P<0.05)。

表2 辣椒碱对泌乳前期奶牛干物质采食量、产奶量及乳成分的影响Table 2 Effects of capsaicin on DM intake,milk yield and milk composition of early lactation dairy cows

2.2 辣椒碱对泌乳前期奶牛血清生化指标的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加辣椒碱对奶牛血清谷胱甘肽抗氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均无显著影响(P>0.05);在试验第60天，辣椒碱组血清中丙二醛含量显著升高(P<0.05)。辣椒碱组血清β-羟丁酸、多巴胺含量显著高于对照组(P<0.05)；辣椒碱组血清胆囊收缩素含量显著低于对照组(P<0.05)；对胰岛素含量无显著性影响(P>0.05)。添加辣椒碱对泌乳奶牛血清中总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖含量均无显著影响(P>0.05)。

表3 辣椒碱对泌乳前期奶牛血清生化指标的影响Table 3 Effects of capsaicin on serum biochemical indexes of early lactation dairy cows

2.3 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃发酵参数的影响

由表4可知，与对照组相比，饲喂辣椒碱后，奶牛瘤胃中各类挥发性脂肪酸含量均无显著改变(P>0.05)。

表4 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃发酵参数的影响Table 4 Effects of capsaicin on rumen fermentation parameters of early lactation dairy cows

2.4 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃微生物区系的影响

表5所示为不同组间细菌优势门相对丰度(相对丰度大于0.5%)，按照相对丰度从高到低依次排列。其中试验组拟杆菌门、螺旋体菌门、纤维杆菌门、髌杆菌门相对丰度高于对照组，但差异不显著(P>0.05)，试验组厚壁菌门相对丰度显著升高(P<0.05)。此外，与对照组相比，试验组变形菌门与蓝藻菌门相对丰度降低，但差异不显著(P>0.05)。

表5 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃优势菌门相对丰度的影响Table 5 Effects of capsaicin on relative abundance of rumen dominant bacterial phylum of early lactation dairy cows

表6所示为不同组间细菌优势属相度丰度(相对丰度大于0.5%)，按照相对丰度从高到低依次排列。与对照组相比，试验组琥珀酸弧菌UCG-001相对丰度显著下降(P<0.05)，瘤胃球菌科UCG-014属与瘤胃球菌科RC9肠道群相对丰度显著升高(P<0.05)，2组之间其他优势菌属相对丰度无显著性差异(P>0.05)。

表6 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃优势菌属相对丰度的影响Table 6 Effects of capsaicin on relative abundance of rumen dominant bacterial genus of early lactation dairy cows %

2.5 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃代谢组的影响

采用PLS-DA模型的VIP(variable importance in the projection)值(阈值≥1)，并结合独立样本t检验(P<0.05)来寻找差异性表达代谢物。检测共计发现45个差异代谢物，利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库，对差异代谢物进行代谢通路注释，找到与这些差异代谢物相关的代谢通路共计102条。首先通过差异代谢物对KEGG、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，然后对对应物种的通路数据库进行搜索和代谢通路分析，其中富集分析P值低于0.05的包含4条通路，分别是万古霉素类抗生素的生物合成、双酚降解、维生素B6的新陈代谢及果糖和甘露糖代谢，4条通路对应的差异代谢物如下表7所示。

表7 4条主要代谢通路对应的差异代谢物Table 7 Different metabolites corresponding to four major metabolic pathways

3 讨 论

3.1 辣椒碱对泌乳前期奶牛产奶性能的影响

研究显示辣椒碱能够增加热应激下奶牛干物质和水的摄入量[10]，在大鼠试验中也发现了相同的结果[11]。但在本次试验中，泌乳前期奶牛饲粮中添加辣椒碱不能显著提高干物质采食量，这一结果与我们之前的试验结果[12]不一致，其可能原因是2组试验牛所处的泌乳阶段和外界环境不一样。有报道称辣椒碱能够增加单胃动物消化酶的合成，从而提高饲粮消化率[13]。在奶牛试验中，研究发现辣椒碱通过降低奶牛氨和甲烷的营养损失，使得食物蛋白质穿过瘤胃直接传送到十二指肠使得氮利用率提高，从而提高奶牛泌乳效率，有助于增加奶牛的产奶量[14]。这些研究佐证了辣椒碱对奶牛干物质采食量无显著影响，却显著提高了产奶量是因为辣椒碱添加提高了奶牛能量利用率。此外，本试验结果显示奶样中乳蛋白率、乳糖率与乳尿素氮含量等不受辣椒碱的影响，这与其他报道的结果一致，膳食蛋白质向牛奶的转移效率相对较低，即使辣椒碱能够增加食物蛋白质的过瘤胃率，也不会显著改变牛奶蛋白质含量[15]。

3.2 辣椒碱对泌乳前期奶牛血清生化指标的影响

本试验中，饲粮添加辣椒碱对奶牛血清谷胱甘肽抗氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均无显著影响，但试验组血清丙二醛含量反而显著升高，其可能原因是试验牛高产奶负荷威胁机体健康，产生更多的自由基，积累丙二醛[16]。奶牛分娩后，胰岛素水平较低，机体干物质采食量无法满足泌乳的能量需求，于是脂肪组织被动员提供能量，大量游离脂肪酸在线粒体中经过酶促反应可以转化为β-羟基丁酸酯，再通过单羧酸转运蛋白转运出线粒体，进入血液循环[17]。因此，血清中β-羟丁酸含量能够反映机体脂肪动员水平和机体代谢状态。在本试验中，饲喂辣椒碱后泌乳前期奶牛血清中β-羟丁酸含量显著升高。有研究显示辣椒碱可能并非直接刺激奶牛机体动员脂肪，而是通过增强乳杆菌代谢活性，加大乳酸杆菌的能量需求间接导致[13]。此外，本研究中试验组奶牛血清多巴胺含量显著高于对照组，胆囊收缩素含量显著降低。在动物试验中，研究发现多巴胺含量与动物采食水平相关[18]，而胆囊收缩素主要作用为刺激胰酶分泌与合成，增强胰碳酸氢盐分泌，刺激胆囊收缩，还可作为饱感因素调节摄食[19]。

3.3 辣椒碱对泌乳前期奶牛瘤胃微生物的影响

反刍动物瘤胃微生物通过分泌不同种类的酶参与饲粮木质纤维性物质的分解，对于调节宿主生理功能和改善胃肠道健康起着至关重要的作用[20]，因此，本研究探索了瘤胃中相对丰度大于0.5%的优势菌群。研究结果显示，辣椒碱的加入对瘤胃厚壁菌门和拟杆菌门有正向影响，其中厚壁菌门相对丰度的增加更显著。在奶牛瘤胃中，拟杆菌门中数量最多的是普雷沃氏菌属，它在多种生物代谢途径中发挥作用，能够将植物蛋白质、多糖、半纤维素和果胶分解转化为乙酸、琥珀酸和丙酸等奶牛机体能够直接利用的能量物质[20]。厚壁菌门细菌细胞壁含肽聚糖量高，细胞壁厚，革兰氏染色反应呈阳性，属于化能营养型[21]。其主要生理功能是降解结构性多糖，同时抑制甲烷的产生[22]。这些报道证明了辣椒碱是通过影响瘤胃优势菌群相对丰度，从而提高机体能量利用率。Sun等[23]研究紫苏叶对泌乳奶牛瘤胃微生物群落的影响，结果同样发现辣椒碱能够提高瘤胃厚壁菌门相对丰度，这些试验表明植物提取物中这些酚类化合物对瘤胃微生物可能具有相似的生物学功能。此外，在本试验中，对照组瘤胃中琥珀酸弧菌相对丰度较高，瘤胃琥珀酸弧菌能够发酵多种糖，主要的代谢终产物是乙酸和琥珀酸[24]。也有研究发现，琥珀酸弧菌和普雷沃氏菌与牛奶合成和瘤胃发酵特性相关[25]。

3.4 辣椒碱对泌乳前期奶牛代谢组的影响

万古霉素类抗生素是一种糖肽类天然抗生素，线性多态结构，主要生物学功能是通过干扰细菌细胞壁的合成而抑制细菌生长，是黄色葡萄球菌的主要抗菌剂，放线菌属或链霉菌属是参与万古霉素类抗生素生物合成的主要微生物[26]。其代谢途径主要化合物有酪氨酸、对羟苯基丙酮酸，而其转氨酶也需要磷酸吡哆醛(维生素B6的代谢中间物)充作辅酶。本研究中显示，与对照组相比，辣椒碱组中瘤胃内万古霉素类抗生素的生物合成通路的代谢活性较弱，维生素B6代谢通路对应的代谢活性则更强。瘤胃内环境中万古霉类抗生素含量降低，对鼠李糖乳杆菌生长繁殖的抑制作用削弱。鼠李糖乳杆菌属于乳杆菌种属，是革兰阳性厌氧菌，可代谢单糖，产生少量醋酸和大量乳酸[27]。总而言之，瘤胃微生态系统是一个动态循环的系统，各种属微生物相生相克，彼此关联影响，辣椒碱通过抑制放线菌属或链霉菌属活性，因而降低瘤胃万古霉类抗生素含量，使得鼠李糖乳杆菌大量繁殖，进而促进奶牛的能量利用、平衡和调节瘤胃菌群的功能。

4 结 论

综上所述，辣椒碱具有促进泌乳前期奶牛产奶的潜力，但对干物质采食量无显著影响，辣椒碱能够通过改变瘤胃菌群结构，影响瘤胃代谢物含量，改善瘤胃内环境。