土壤中抗生素类物质的分析研究进展

吕振娥

(乌鲁木齐市米东区农产品质量安全检测中心，新疆 乌鲁木齐 830000)

1 抗生素污染及监测研究现状

1.1 医药品和个人护理品引发的环境问题

一般来说，日常生活中经常使用的化学产品如医药品、化妆品等统称为“医药品和个人护理品”，即PPCPs。对于医药品，目前大约有4500种被广泛使用，而个人护理品的全球年生产量也已超过106t，因此PPCPs成为了一类“新型”化学物质，且呈现出一种持续存在的状态，被科学家们称为“虚拟持久性化学物质”[1]。

PPCPs被源源不断地输入环境，导致其在环境中的残留量不断增大，最终可能危害到人类的生产生活以及生态环境安全。但目前人类对其认识还非常有限，因此有必要对其存在现状进行更广泛和深入的研究。由于PPCPs自身存在种类繁多、半衰期短和浓度低等特点，使建立同等条件下高灵敏、高特异性的多种污染物类别的同时检测分析方法成为PPCPs研究领域的一个关键。

1.2 环境中抗生素的来源及负面效应

1.2.1 环境中抗生素的来源

抗生素属于众多的PPCPs类物质中使用较为广泛的医药品类，其能引起抗药病原菌的选择性存活，目前已受到学术界的广泛关注。1940年以来，抗生素被大范围使用，主要用于预防和治疗疾病或者促进动物生长。临床常用的类别主要包括四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类和磺胺类等。

目前，全球每年使用的各种抗生素总量已超过20万t[2]。1999年，欧盟和瑞士用于人体健康和动物疾病、生长促进作用的抗生素用量分别达到8637.2t和3853.5t[3]。统计显示，美国从1995—2002年，喹诺酮类和磺胺类抗生素位于前200种最经常用的处方药之中，而我国在2003年，青霉素和土霉素的生产量占到了世界总产量的60%和65%[1]。在我国医院使用量与销售量排名中，前15名药物中有10种均为抗生素。因此，过度使用抗生素的现象已经非常普遍。

抗生素经人体或动物摄入后，85%以原形或代谢产物的形式排放进入环境[3]。由于绝大多数的抗生素具有极性高的特点，因此水环境中的抗生素普遍存在。在污水处理过程中，一些抗生素类物质无法被有效去除，从而排入天然水体；人类丢弃或者动物等摄入后排出的抗生素可能通过施肥等各种途径进入土壤；通过水循环，地表水体、土壤等介质中的抗生素可能污染到饮用水；另外，企业废水特别是制药厂、养殖业废水的无监管乱排现象也是不容忽视的。目前在水体、食品、沉积物、动物粪便以及土壤中都广泛地检出了抗生素残留[3]。

1.2.2 抗生素的危害

抗生素的过度使用会增强一些细菌等微生物的耐药性，而随着耐药微生物的不断增多，其最终将成为环境中的优势菌并不断繁殖，即使环境中的抗生素污染可以消除，已经形成的耐药微生物仍然会在环境中持续存在，从而威胁到人类的生存环境。

目前，四环素、磺胺、β-内酰胺等抗生素的耐性微生物已经广泛出现于污灌土壤、污水处理厂出水、河道沉积物，甚至饮用水中，且在新研制的抗生素中也存在这种情况，如喹诺酮类抗生素[4]。据统计，2001年美国医院50%～60%的感染均源于耐药菌。在1994—2008年，荷兰土壤中抗生素耐药基因的水平最高达到20世纪70年代的15倍[5]。同时，耐药微生物不仅表现为对某一种抗生素产生耐药性，某些菌株甚至可以同时对100多种抗生素产生耐性。此外，耐药基因还可以发生重组、水平转移，继而在环境中传播[5]。

除耐药性外，环境中低浓度抗生素的持续存在还会对水生生物、植物、动物产生遗传毒性、慢性毒性和致癌性等生态毒性，并影响环境中各种微生物的数量和种类结构，从而破坏原本和谐的生物之间的联系和平衡。虽然目前抗生素的生态风险评价均是基于有限的监测和对生物的毒理数据，但已经初步表明其对生物圈具有一定的危害。

1.3 环境中抗生素类物质的监测现状

1.3.1 抗生素的仪器分析方法

抗生素的残留分析最早于20世纪90年代开始，气相色谱-质谱(GC/MS)是当时最主要的分析手段。由于大多数药物具有不易挥发或热不稳定的特点，因此使用GC/MS检测环境中的抗生素存在一定的限制因素。

近年来，对于多组分抗生素残留的分析多采用高效液相色谱(HPLC)，而检测器除了紫外、荧光时有应用，质谱尤其是串联质谱由于具有较高选择性和灵敏性已成为主流的定性和定量手段[6]。在质谱的使用过程中，离子源的选择是很重要的。大气压化学电离(APCI)基质效应小，但实际环境中的抗生素残留浓度往往是痕量，因此偏低的灵敏度使其在检测中受到一定限制。而ESI源虽然受基质影响较大，基质干扰会减少离子化效率，使基线升高，方法灵敏度降低，可能导致检测结果错误，但由于其对极性、弱极性及热不稳定性物质良好的适用性，成为了抗生素分析中最频繁使用的离子化方式。因此，LC-MS/MS分析中一个典型的问题就是基质效应。在提取或富集浓缩目标物质时，往往会共存大量的杂质，而且这种抑制作用不但在复杂介质如土壤和沉积物中存在，甚至分析饮用水中也存在(四环素、磺胺、喹诺酮)。

对于基质效应，目前部分研究者通过使用内标法定量、同位素标记以及减少进样量的方法以使结果更可靠，但内标法太耗时，同位素标记内标太昂贵且不易购买，因此大部分研究者并未提及此类问题，也尚未有明确的解决方案。近年来四极杆串联飞行时间质谱(QTOF)逐渐被用于药品的环境分析中，其可以同时对近百种药物进行检测，具有更佳的定性能力。随着人们对环境分析的准确度的不断提高，开发更加灵敏的不同种类多组分残留分析技术已成为抗生素环境分析领域的必然趋势。

1.3.2 环境中抗生素样品制备方法

样品制备的主要目的是分离出非目标物质，使目标物质的纯度和浓度得到提高，为后续的仪器分析做好准备，因此样品的物化性质以及基质性质就成为了样品前处理的重要影响因素。样品制备过程包括酸碱度的调整、萃取过程中加入螯合剂、对萃取液进行处理以及为色谱分析进行的准备工作等。

有文献报道，四环素类(TCs)和氟喹诺酮类(FQs)抗生素可与环境中的二价金属离子形成复杂螯合物，从而不可逆地吸附在固相萃取柱上或者黏附在玻璃器皿上。因此，需要向环境样品中加入螯合剂，如乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、草酸或柠檬酸，以去除干扰、改善峰形，其中Na2EDTA是最常用的手段。此外，实验过程中使用稀硝酸浸泡玻璃器皿也是改善回收率的方法之一。

对于环境中抗生素的富积净化，固相萃取(SPE)因具有速度快、稳定性好、绿色环保等优点而成为主流方法。在固相萃取柱的选择上，有文献研究[7]将亲水亲油平衡HLB柱、强阳离子交换MCX柱和C18柱进行对比，结果发现,MCX柱对酸性物质具有较好保留效果，但对于碱性和中性化合物，回收率则偏低，因此为了高效率地萃取碱性物质，样品的pH值必须调低；C18柱对于大多数物质都是适用的，但含有自由硅醇基团，会与四环素类抗生素发生不可逆的结合，从而降低富集效率。Lindsey等通过比较4种固相萃取柱(500mg C18、150mg ENV+、60mg HLB、500mg HLB)分析水体中6种磺胺和5种四环素的富积效果，结果显示，四环素类不能从C18和ENV+柱上洗脱下来。因此，HLB柱(由亲脂烷酮的二乙烯基苯和亲水的N-乙烯基吡咯烷酮2种单体按比例聚合而成)较其它萃取柱具有更高的萃取效率，pH(1～14)范围也更广，适用于所有物质，美国EPA对74种医药品的富集均是采用的HLB柱。但是，HLB柱会富集大量的杂质，近年来部分研究者采用串联SPE柱，如C18-HLB、SAX-HLB等，通过串联柱的进一步净化成为了降低基质效应的方法之一。

固体样品中抗生素的前处理较水体中的多一个提取步骤，目前提取方法有微波辅助(MAE)、加压溶剂萃取(PLE)、震荡-超声、加速溶剂萃取(ASE)等，其中最常用的是超声-震荡-离心和ASE 2种提取方法。在提取液的选择方面，通常采用缓冲液如磷酸、McIlvaine(柠檬酸与磷酸盐混合液，pH 4～6)、柠檬酸等与一定比例的有机溶剂如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等混合。如，EPA关于固体介质中医药品提取的标准方法是选用磷酸盐缓冲液(pH=2)和乙腈，回收率在20%～260%。固体样品提取液经过进一步的固相萃取富集后再进行测定，HLB柱仍然是最常使用的固相萃取柱。马丽丽等[7]对比了ProElut C18、HyperSep Retain PEP、HyperSep C18和Oasis HLB 4种反相萃取柱对土壤中四环素、磺胺和喹诺酮的富集效果，结果表明，以聚合物为填料的HyperSep Retain PEP柱和Oasis HLB明显较硅胶键合的C18柱所得到的回收率高，而同时提取这3类抗生素时，Oasis HLB的效果最好。但目前固体介质中分析的物质和手段还很有限，提取效率和基质效应是一个重要的制约因素。

1.4 环境中抗生素残留研究进展

目前，关于城市污水处理厂[8]进出水中抗生素残留情况的报道层出不穷，范围涵盖了欧洲、北美、非洲和亚洲部分国家，其中最频繁报道的几种抗生素类物质主要是SMX(20～870ng·L-1)、TMP(7～1340ng·L-1)、CIP(20～600ng·L-1)、OFL(20～600ng·L-1)、NOR(30～120ng·L-1)和ERY(15～2054ng·L-1)。且关于地表水体中抗生素的浓度水平在美国、德国、英国和巴西等已经广泛报道。Kolpin等较全面地分析了美国30个州内139多条河流水中农药、医药、兽药、激素等95种有机污染物，其中抗生素浓度均在μg·L-1级[9]。而在我国珠江、香港和海河流域中抗生素的浓度在3～410ng·L-1。饮用水作为直接暴露途径，与人们的健康息息相关，USGS在2000年和2001年对本国饮用水源的普查时检出了SMX、TMP、SMA、ERY、CIP等抗生素类物质，浓度水平最高已达到1110ng·L-1[10]。

已有的研究表明，不同种类抗生素在土壤环境中的浓度范围在0.1～2683.0μg·kg-1，其中土霉素在土壤中的残留量最大。加拿大土壤环境中四环素浓度可达到52μg·kg-1，我国北方土壤中四环素和金霉素的残留浓度分别为20.9～105.0μg·kg-1，33.1～1079.0μg·kg-1[11,12]。西班牙农田土壤中磺胺类抗生素的平均浓度为0～50.53ng·g-1[13]，美国施用粪肥土壤中检测到磺胺甲恶唑的浓度为34.5～663ng·kg-1[14]。氟喹诺酮在土壤中的残留浓度范围在μg·kg-1～mg·kg-1，东莞蔬菜地4种喹诺酮的检出率均为90%以上，总含量为0～554.1μg·kg-1，瑞士施用城市污泥土壤中诺氟沙星和环丙沙星含量分别为0.27～0.4mg·kg-1和0.27～0.32mg·kg-1[15]。目前的研究中，施肥后土壤中检测到四环素类、磺胺类和喹诺酮类抗生素的最大浓度依次为0.3mg·kg-1、0.015mg·kg-1和0.37mg·kg-1[17]。由此可见，不同地域、不同类型土壤中抗生素的含量差异较大。

2 抗生素污染及监测研究现状小结

抗生素作为PPCPs的一大类，已经被研究了10a多，尤其是水环境中的抗生素环境污染得到了广泛的关注，但关注的物质仍十分有限。而有关固体介质如土壤中抗生素的残留情况的报道还相对较少，此外，关于其进入环境的代谢产物的研究还十分匮乏。由于土壤环境相对较复杂，分析方法的有限性可能是限制当前土壤中抗生素环境研究的一个重要原因。这种限制性着重体现在样品的有效前处理和分析的灵敏度上，这类物质在环境中普遍浓度低，且极易受到基质干扰。因此，需要建立一种可以同时检测多种抗生素物质包括其代谢产物在内的分析方法，检测尽量多的物质，从而系统全面地探析这类物质的环境污染特征，为研究其风险及以环境管理策略提供依据。特别是作为一个抗生素的生产和使用大国，我国环境中抗生素的种类、浓度水平和环境影响可能和别国有所不同。