文冠果幼胚的组织培养和植株再生

张成华 于海燕 秦兆宝

摘要：本文研究了文冠果成熟胚的分生力。结果表明：文冠果幼胚接种在 MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基上，丛生芽诱导率为83%。继代增殖在MS+BA0.5mg/+NAA0.11mg培养基上，繁殖系数最高达4倍以上，生根诱导培养基为1/2MS（大量减半）+IBA1.8mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂6.5g/L，生根率达87%。

关键词：文冠果胚;组织培养;植株再生

文冠果是我国北方重要的木本油料树种，据资料报道文冠果种子含油率30-60%，种仁含油率55-60%。除种子供医药和食用油料外，还可作高级润滑油、增塑剂、油漆、肥皂等工业原料，近年来亦被认为是一种很有开发潜力的生物能源植物;油饼可提取蛋白质和氨基酸，也可作精饲料;果皮能提取糠醛;叶子可蒸炒加工成茶叶。文冠果也是一种生态优良的绿化观赏树种。

文冠果不同种源的种子含油量存在明显差异，因此对种子含油量高的文冠果种源进行大量繁殖，具有非常广泛的应用前景。采用组织培养技术是发展大规模、快速繁殖优良文冠果的必然选择，加速优树繁殖，提高单位面积产量。

1 文冠果幼胚（非成熟胚）诱导丛生芽的发生

1.1 材料和处理

1.1.1 种源：选用选优的当年采摘的新鲜成熟种子。

1.1.2 种子预处理：将种胚剥离外面的种皮，种子用洗衣粉搓洗3-4次，用温水洗涤多次，并在温水中浸泡24小时，然后用单面刀片在外种皮上切一小口，剥开种皮，备用。

1.1.3 种仁消毒处理：将种仁放在超净工作台上，打开紫外灯灭菌15min，再用75%乙醇消毒1min，接着把种仁放入0.1%Hgcl2中消毒3.5min，并要轻轻摇动烧杯，以使消毒剂与种仁充分接触。用无菌水洗涤4次，每次冲洗时间不少于1min，最后用滤纸吸干种仁表面的水分。

1.2 启动培养基配制

从文冠果幼胚诱导丛生芽，选用MS培养基，摸索细胞分裂素（如BA）和生长素（如NAA）的最佳配比，寻找高诱导率的启动培养基配方。

1.2.1 启动培养基配方设计

设计BA和NAA两个因子，其中BA设计7个浓度水平，NAA设计3个浓度水平。用交叉分组方法设计实验。每个培养基组方做20瓶，每瓶放入2粒消毒的种仁。

1.2.2 培养条件

接入种仁后的培养瓶（见图1），放培养室进行培养。温度控制在20-28℃之间，光照强度为2000-3000LX，每日光照14小时，20d后观察试验结果。

1.2.3、实验结果

在20d培养的时间里，有的幼胚可长出丛生芽，有的幼胚无法诱导出丛生芽，有的幼胚死亡。现将实验结果列入于下（见表1）

1.2.4、对实验结果进行方差分析和显著性检验

同一株文冠果树上结的种子，其基因型都各不相同，因此种子间差异是属于无法控制、无法预料的随机因素。而培养基中的BA和NAA两因素的影响都属于可控制、可重复的因素。因此在同样培养条件下，使用同样配方进行的几次实验，可视为重复，它们之间的差异是由随机误差所致。

方差分析可以验证上述实验设计的正确性。不过，做方差分析时，当因素增加到3个或3个以上时，由于分析计算复杂性大増，所需实验次数也将以几何级数增加。因此在方差分析中，3因素及3因素以上方差分析较少用到，一般实验中多用到2因素方差分析。以下是对BA和NAA两因素方差所进行的分析。由于BA为0.3、0.5、1.0时，都进行了NAA三个水平实验。因此，就选择了两者相对应的浓度水平进行方差分析。同时由于BA为0.9和1.0时，它们浓度较近，但它们的诱导率差异却是明显的。因此，选择了BA浓度为1.0时做方差分析。

5.32是位于4.46与8.65之间，因此F1达到显著，而F2仅为0.67，小于4.46，因此F2属于不显著。NAA浓度变化对丛生芽诱导试验的影响不显著。

该实验结果，与已知的植物激素生理作用机理相吻合。即有BA促进细胞分裂，组织増大，产生愈伤组织，诱导芽分化等作用;而NAA作用它既影响细胞分裂，伸长和分化，也影响影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老。

2 文冠果继代培育和扩繁

选择生长旺盛的芽丛做继代培育（见图2），但是，继代培养基不同启动培养基，所以必须重新进行继代培养基组方筛选。

将丛生芽生长旺盛的丛苗分割成若干单株，它都能分別进行分化，生长出许多丛生芽。这样，无异于从一块“优良”的愈伤组织，可以得到无数的继代苗，因此也称之为扩繁。从幼胚分化出的丛生芽具有两个明显的优点：一是基型类型多，有利于优良苗木选育;二是容易进行继代培养。

2.1 继代苗培养基筛选

继代培养基配制的原则，基本上与诱导丛生芽培养基相同：以MS为基础培养基，用交叉分组方法寻找BA和NAA最佳组方。由于是长苗，因此仍要求 BA/NAA的高比值。其观察比较指标是繁殖系数，即在一代继代培养中，由一个繁殖单位（如一个芽丛或芽）得到的新苗的个数。

2.2 方差分析

0.79、0.35都小于4.46和8.65，因此FA和FB均属于不显著。即把丛生芽块切割后，只要在培养基中将BA和NAA浓度控制在一定范围内，基本都能促进芽生长成新苗，但难以区分到底是BA还是NAA对小苗生长的影响更大。根据实验结果我们发现BA0.4mg/L和NAA0.8mg/L的组合对继代苗繁殖系数影响最大。

3 文冠果继代苗生根

将培养高2-3cm的继代苗，切下转移到生根培养基上继续培养，使其长出不定根，形成完整小苗。

3.1 生根培养基筛选

生根培养基组方中，以1/2、1/4、大量元素减半三种MS培养基作为基础培养基，因此，根据以往经验，在文冠果幼苗诱导培养基中，只是加入IBA并辅以NAA，诱导继代苗生根，而不能加入细胞分裂素。同时，试验了 White、B6培养基，以及1/2 white組方。

在生根培養中，交叉分组方法配制组方。而每一培养基配方重复4次，每次20瓶。生根培养的观察指标是在15d以内。

3.2 实验结果

IBA和NAA是两种化学合成、具有生长素类似效应的植物生长调节剂。虽然它们都具有诱导组培苗生根作用，但是其效应却并不相同：IBA作用强烈，作用时间长，所诱发的根多而长;而NAA诱发的根少而粗。为此，在实际应用中，它们常搭配使用。但是，在不同物种中，IBA和NAA使用浓度各异，效果也千差万别。

试验结果显示，White、B5以及1/2 white、1/4white配方都很不理想，而实验结果，基础培养基以1/2MS、1/4MS与IBA、NAA组合较为理想。

3.3 方差分析

由方差分析可知，4.00是位于3.63和6.23 之间，因此Fa达到显著;而FB为2.32，小于3.63，因此FB属于不显著。即，在IBA和NAA在一定浓度范围内，IBA的浓度变化对诱导文冠果继代苗影响显著，而NAA浓度变化影响不显著。

在本试验研究中发现，在诱导文冠果继代生根时，以NAA为0.5mg/L和IBA为1.8mg/L最为理想（见图3）。

3.4 用正交设计寻找更佳组方

做正交设计验证是否IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L是最佳组合。

使用L4（23）正交表做3因子2水平试验设计

正交设计试验表明，在上述NAA和IBA最佳配比的各种浓度配合中，继代苗生根率皆低于IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L配方。为此，可以判断使用的一系列文冠果继代苗生根培养基中，该配方为最佳配方。

4 文冠果的组培苗移栽

4.1、驯化炼苗

我们选择3-5条生根良好的健壮苗，打开瓶盖，在室温下驯化锻炼一周，湿度在50-60%，温度保持在18-28℃。

4.2、基质准备

将基质经太阳暴晒一天，按照珍珠岩+草碳土=2：8混合均匀，混合时加入杀菌剂进行消毒。

4.3、移栽

取出小苗，去净根部的培养基，用800倍的百菌清溶液速蘸，ABT1号400ppm生根溶液速蘸进行处理，深栽浅埋，不要握根，栽入营养钵进行培养。移栽后浇少量水，搭上拱形棚，盖上遮阴网，保持湿度在75-90%，温度在20-30℃，培养10d左右，根系生长出新的根，叶片增加，慢慢进行通风和去掉遮阴网，进行喷施植物生长调节剂GGR6号10ppm溶液叶面肥料，促使生长健壮，有利于快速出圃。

4.4、移入大田苗圃

1个多月后，小苗长的粗壮、旺盛，移入苗圃可以大田栽种。

用文冠果的幼胚通过不同组方进行快繁培养，实现了良好的繁殖系数，为文冠果大规模化生产提供了可靠的理论和技术服务，同时为我们实现文冠果组培工厂化育苗铺了一条新路。

参考文献

[1]王永明，赵静茹，陈颖. 文冠果的组织培养[J]. 植物生理学通讯，1986（01）：44.

[2]宋群雁，王丽艳，矫洪双，等. 文冠果组织培养和植株再生研究[J]. 北方园艺，2013（7）：4.

[3]王一. 文冠果组织培养技术研究[D]. 内蒙古农业大学，2012.

[4]方志军，刘克林，刘春和，等. 文冠果组织培养技术初步研究[J]. 绿化与生活，2015（2）：2.

课题项目：“十二五”国家科技支撑计划“生物质液体燃料资源植物品种选育和丰产栽培技术示范”课题（2011BAD22B08）。

作者简介：张成华 （1973.10-）、女、汉族、中级农艺师、主要从事植物的组织培养研究与繁育工作27年。