基于转录组学研究雷公藤甲素对仓鼠卵巢细胞毒性的分子机制

程 坦，高 宁，郑晓玲，应牡英,*

1南昌大学玛丽女王学院，南昌 330006；2黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；3南昌大学基础医学院，南昌 330006

雷公藤甲素(triptolide)属环氧二萜内酯化合物，是中药雷公藤的主要有效成分。现代药理学研究表明，雷公藤甲素能够诱导细胞凋亡、调节自噬、抑制细胞周期、抑制血管生成、抑制促炎细胞因子表达，从而具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、神经保护等多种药理学作用，雷公藤甲素相关制剂在临床应用中也得到广泛认可[1]。然而，与其优良药效相对应的，雷公藤甲素在临床应用中亦表现出了明显的毒副作用。多项体内外研究均表明，雷公藤甲素能够对于肝脏、肾脏、卵巢等多个器官造成损伤，极大地限制了雷公藤甲素的临床应用与开发[2]。因此，深入了解雷公藤甲素毒副作用的分子机制，对于优化临床用药、设计新的衍生物、降低毒性、提高安全性等均具有重要意义。

雷公藤甲素的生殖毒性一直受到研究者的关注，然而多数研究均集中于雷公藤甲素引起的卵巢等器官的病理学改变及相关生理生化指标异常，对于毒性相关的分子机制研究并不深入[3]。由于雷公藤甲素能够通过调节多条途径实现其药效作用[1]，因此对其毒性机制研究也应从整体考虑。本研究以中国仓鼠卵巢细胞为模型，利用转录组测序技术研究雷公藤甲素给药前后卵巢细胞基因表达整体变化，以期为雷公藤甲素引起卵巢损伤的分子机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)，购自中科院上海细胞库，由本实验室传代并液氮保存。

1.1.2 药品与试剂

雷公藤甲素(成都格利普生物科技有限公司)；DMEM培养基(Sigma，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；青霉素-链霉素溶液(赛默飞(北京)公司)；胰蛋白酶(Gibco，美国)；PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；SV Total RNA Isolation System总RNA提取试剂盒(Promega，美国)。

1.1.3 仪器设备

CO2细胞培养箱(施都凯(上海)有限公司)；低速离心机(Beckman，德国)；低温离心机(Eppendorf，德国)；超净工作台(上海博迅实业有限公司)；超纯水系统(Mllipore，美国)；RT-6000酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与给药

冻存的CHO细胞经常规方法复苏，培养条件为：含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养温度37 ℃，CO2浓度5%。取对数生长期的CHO细胞，按1×106cells/mL的浓度接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h后，弃去培养基，参照文献[2]及课题组前期预实验结果，加入含有80 nM雷公藤甲素的无血清培养基(给药组)，以无血清培养基培养作为对照组，每组设3个重复。培养24 h后，提取RNA进行转录组测序。

1.2.2 RNA提取与转录组测序

细胞给药结束后，经胰酶适当处理，按总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法检测总RNA的浓度与纯度，要求18S rRNA与28S rRNA电泳条带清晰、无拖尾，A260/A280在1.9～2.0之间。检测合格的总RNA用Oligo(dT)磁珠法富集纯化mRNA，片段化后逆转录合成双链cDNA，添加测序接头、USER酶解、PCR扩增、AMPure XP beads纯化，最终构建链特异性cDNA文库。经质检合格的文库进行HiSeq测序，得到原始数据raw reads，采用Trimmomatic v0.36软件对原始数据过滤，去除接头序列及低质量序列，得到clean reads。采用HISTA2软件，将clean reads与ENSEMBL数据库(www.ensembl.org)中参考基因组(GCF_000223135.1_CriGri_1.0_genomic.fa)进行比对。利用featureCounts v1.5.0软件通过HISTA比对产生的SAM比对文件和基因组的GTF注释文件来计算每一个基因拥有的reads数量，然后根据外显子的长度以下述公式计算基因的FPKM值(fragments per kilobase million，即在每百万个Reads值中，来自某基因每千个碱基长度的Reads数)来表示基因的表达量。利用DESeq2软件基于负二项分布比较对照组与给药组间基因表达差异，以差异倍数|log2FoldChange|>1，且校正后P值(p.adj)Q<0.05为标准筛选得到差异基因(differentially expressed genes，DEGs)。转录组测序及差异基因筛选部分由武汉博越致和生物科技有限公司协助完成。

1.2.3 差异基因功能分析

基于基因本体数据库(Gene Ontology，GO)与京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)，利用ClueGO软件对差异基因所涉及的GO生物学过程(biological process)进行富集分析，并利用Cytoscape 3.1软件绘制各GO条目间相互关系。利用在线数据库STRING 11(https://string-db.org/)分析差异基因所涉及的KEGG通路(KEGG pathway)并建立差异基因所表达的蛋白间相互作用关系网络。综合分析结果，探讨雷公藤甲素对卵巢细胞CHO毒性作用的分子机制。

1.2.4 统计学方法

DEGs的功能富集分析，如文中设计的GO、KEGG分析，采用Fisher精确检验，并以P<0.05作为阈值。

2 结果

2.1 差异基因的筛选

原始测序序列经过滤除去低质量reads后，与仓鼠基因组数据进行比对分析，结果显示各实验组Q30(测序质量分数大于30的碱基占所有碱基的百分数)大于95%，整体比对率大于80%，测序质量良好(表1)。基于FPKM值比较给药组与对照组基因表达差异，共筛选得到差异基因740条，其中上调286条，下调454条；同时，以不同样本间表达量方差最大的50个基因用于样本层次聚类分析，结果如图1。

表1 Clean reads的质量与比对结果Table 1 Quality and mapped rate of clean reads

图1 基因表达水平分析结果Fig.1 Results of genes expression analysis注：A.样本表达量分布图；B.样本聚类结果。Note:A.Violin plot for expression level;B.Hierarchical clustering analysis results of samples.

2.2 差异基因的GO生物学功能分析

基因本体(Gene Oncology，GO)是由基因本体联合会(Gene Ontology Consortium)建立的在线生物数据库，用于对基因及其蛋白功能进行注释，主要分为生物学过程(biological process，BP)、细胞组件(cellular component，CC)和分子功能(moelcular function，MF)三个类别。基因本体已成为从整体掌握差异基因功能变化的重要工具。将上调的286条差异基因导入ClueGO中，以Cricetulusgriseus为物种背景，利用Functional Analysis富集分析差异基因涉及的BP、CC和MF。结果表明，上调基因共富集于16个生物学过程、4个细胞组件和5个分子功能(见图2)。通过分析GO功能间的关系可知，上调基因所涉及的生物学过程(BP)主要分为异戊二烯类成分的合成与代谢(GO:0008299、GO:0006720)、细胞及器官发育(GO:2000026、GO:0045595、GO:0050793等)、细胞粘连(GO:0098609、GO:0098742、GO:0007156)与细胞对内源性刺激的应答(GO:0071495)几个方面(见图3)。

图2 上调差异基因GO富集结果Fig.2 Enrichment results of up-regulated DEGs based on GO function

图3 上调基因涉及的GO功能间相互关系Fig.3 Relationship between the GO term of up-regulated DEGs注：A.BP；B.MF；C.CC。

在利用ClueGO对下调基因进行GO功能分析时发现，受雷公藤甲素抑制的454条基因富集于18个生物学过程、7个细胞组件和2个分子功能(见图4)。其主要的生物学功能以形态发生(GO:0009653、GO:0032989、GO:0000902等)与信号转导通路的调控(GO:0007166、GO:0009966、GO:0010469等)两个方面最为重要(见图5)。

图4 下调差异基因GO富集结果Fig.1 Enrichment results of down-regulated DEGs based on GO function

图5 下调基因涉及的GO功能间相互关系Fig.5 Relationship between the GO term of down-regulated DEGs注：A.BP；B.MF；C.CC。

2.3 差异基因的KEGG代谢与信号通路分析

KEGG全称为京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，其集成了近7 000种生物的基因功能信息及其所参与的代谢与信号转导通路，并利用图形界面将各基因间相互关系展现出来，使研究者能够直观掌握分析数据的生物学意义。利用STRING 11对差异基因参与的KEGG通路进行分析发现，差异基因共涉及22条KEGG通路，其中富集显著性前3位的分别是胆固醇生物合成(cge00100)、MAPK信号通路(cge04010)以及癌症中的转录失调(cge05202)。其他富集显著性较高的KEGG pathway则主要包括多种信号转导通路(cge04151、cge04657、cge04668、cge04068等)以及癌症(cge05210、cge05220)、类风湿关节炎(cge05323)等疾病相关通路(见表2)。

表2 差异基因的KEGG通路富集结果Table 2 Enrichment results of DEGs based on KEGG pathway

3 讨论

雷公藤甲素具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等多种药理作用，临床上常用于类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的治疗，取得了较好的应用效果。然而，其同样能够损害卵巢功能、诱导卵巢细胞凋亡，引起月经不调、闭经、卵巢早衰等多种生殖系统问题，但对于其卵巢毒性的分子机制尚不清晰[3]。本研究以仓鼠卵巢细胞系为模型，检测并分析了雷公藤甲素对卵巢细胞基因表达的影响。综合GO生物学功能及KEGG代谢及通路分析结果发现，雷公藤甲素对IL-17信号通路(cge04657)与TNF信号通路(cge04668)具有促进作用，对于PI3K-Akt信号通路(cge04151)则显示抑制作用。

白细胞介素-17(Interleukin 17，IL-17)家族目前共发现6个成员，依次编号为IL-17A至IL-17F，其通过与受体相互作用，激活包括NF-κB、MAPKs和C/EBPs等下游通路，诱导抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达，从而在保护宿主免受细胞外病原体的侵袭方面发挥重要作用[4]。然而，大量研究显示，IL-17信号通路异常，是许多炎症性疾病的关键诱因[5]。IL-17的表达水平与银屑病、多发性硬化、强直性脊柱炎、癌细胞的侵袭等均密切相关[4]。在卵巢相关疾病的研究中，IL-17与卵巢癌的关系研究最为普遍，研究证实IL-17能够促进卵巢癌恶化并可作为预后不良的潜在标志物[6]，而卵巢子宫内膜异位[7]、多囊卵巢综合征[8]以及卵巢早衰[9]也被证实与IL-17的表达异常有关，同时，雷公藤多苷片也已被用于大鼠卵巢早衰疾病模型的建立[10]。通过转录组测序及富集分析结果可以发现，雷公藤甲素能够提高il17c、traf6、fos、cxcl1、cxcl3、ptgs2等基因表达水平，从而促进卵巢细胞IL-17信号通路及下游基因表达(见表3、图6)，这可能是雷公藤甲素卵巢细胞毒性甚至诱发卵巢早衰的主要因素。

图6 雷公藤甲素促进CHO细胞IL-17信号通路Fig.6 Facilitation of IL-17 signaling pathway in CHO cells promoted by triptolide注：图中标记基因均上调。Note:The genes marked in the pathway were up-regulated.

表3 部分与雷公藤甲素卵巢毒性相关的差异基因Table 3 Partial DEGs related to the ovarian toxicity induced by triptolide

肿瘤坏死因子(TNF)是一种多效性的细胞因子，包括TNF-α与TNF-β，二者受体相同，能够诱导一系列的胞内信号通路，在抗肿瘤应答、控制炎症以及免疫系统稳态平衡等方面均发挥重要作用。研究发现，TNF受体存在于几乎所有类型的细胞中，TNF与其受体结合后，通过招募TRADD、TRAF2等连接蛋白，进一步诱导下游基因活化，产生应答。其中TRADD下游效应主要为细胞凋亡及抗炎作用，而TRAF2下游效应则主要为抗细胞凋亡及炎症信号。作为重要的促炎性细胞因子，肿瘤坏死因子异常表达能够导致系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、克罗恩病等多种疾病[11]。现有研究结果证实，卵巢子宫内膜异位、多囊卵巢综合征以及卵巢早衰患者血清TNF-α水平明显升高，表明其在卵巢损伤过程中扮演重要角色[12,13]。通过转录组测序及富集分析结果可以发现，雷公藤甲素能够提高traf1、traf5、fos、cxcl1、csf2、vcam1等基因表达水平，促进TNF信号通路及下游基因表达(见表3、图7)，这可能是雷公藤甲素引起卵巢细胞病变的重要诱因。

图7 雷公藤甲素促进CHO细胞TNF信号通路Fig.7 Facilitation of TNF signaling pathway in CHO cells promoted by triptolide 注：图中标记基因均上调。Note:The genes marked in the pathway were up-regulated.

磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)能够被多种细胞刺激或毒性损伤所激活，在转录、翻译、细胞增殖、生长等过程中发挥作用。该通路在哺乳动物卵泡的激活、生长及排卵过程中具有重要作用。转录组分析结果显示，雷公藤甲素能够抑制PI3K-Akt信号通路从而影响卵巢细胞形态发生(GO:0009653)，这与已报道的研究结果相一致[14]，也间接证明了本研究结果的准确性。

此外，富集分析结果显示，雷公藤甲素能够促进卵巢细胞胆固醇的生物合成(cge00100、cge00900、GO:0008299、GO:0006720)。研究证实雌二醇匮乏会影响脂代谢、引起胆固醇增高，因此机体胆固醇含量与雌二醇含量呈负相关[15]，而雌二醇缺乏是卵巢早衰的重要病理指标。同时有研究表明，雷公藤甲素能够诱发大鼠血脂异常，造成脂肪肝毒性[16]，本研究结果则说明，雷公藤甲素对于卵巢细胞脂代谢的影响对其卵巢毒性可能具有促进作用。

除上述通路外，其他富集显著性较高的作用则主要与雷公藤甲素的药理作用机制相关，如MAPK信号通路[17]、p53信号通路[18]、ECM受体相互作用[19]等信号转导通路以及类风湿性关节炎[20]、癌症[21]等疾病相关通路，且与已有研究结果相符。

综上可知，雷公藤甲素能够通过影响IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、胆固醇代谢等多种途径扰乱卵巢细胞信号转导与代谢过程，从而造成卵巢细胞损伤，产生卵巢毒性。研究结果为进一步明确雷公藤甲素的毒性作用机制提供了有益的参考。