酸枣仁汤对氯苯丙氨酸诱导失眠大鼠模型治疗机制的研究

刘昊，韩昌胜，迟显苏，杨振霄，王祥宇，王新，马柯

(山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355)

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 实验药物

地西泮、PCPA、吐温80、生理盐水(山东中医药大学实验室)，酸枣仁汤(山东中医药大学国医堂医院)。

1.1.3 实验仪器

BAS224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，5 mL、10 mL注射器(江西洪达医疗器械集团有限公司)，灌胃针头(北京创博环球生物科技有限公司)，旷场实验系统(上海欣软XR-XZ301)，高架十字迷宫系统(上海欣软XR-XG201)，SMART 3.0动物行为学视频采集与分析系统、SuperMaze动物行为学视频分析系统、大鼠雌二醇(E2)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海宸功生物公司)，离心机(力辰科技 LC-LX-HL210D)。

1.2 实验方法

1.2.1 药物制备

酸枣仁汤根据仲景原方换算，为计算方便，按照古代的1两相当于16 g来换算 ，酸枣仁汤配方剂量为：酸枣仁110 g[10]、茯苓32 g、川芎32 g、知母32 g和甘草16 g，煎取600 mL，放入4 ℃冰箱保存备用。

因PCPA较难溶于水，故先用吐温80助溶，再加入生理盐水配制成溶液，现用现配。地西泮粉末经生理盐水溶解后配置成溶液，现用现配。

1.2.2 动物分组

实验动物按照随机数字法分为4组，分别为酸枣仁汤组、地西泮组、模型组和空白组。每 10 只大鼠(雌雄各半)为一组，雌雄两性分别置于两个 RVC 笼子内，大鼠的饲料和饮水采用任食任饮方式。

1.2.3 造模方法

实验采用腹腔注射PCPA的方法构建大鼠失眠模型，将需要配制使用的PCPA混合摇匀，模型组、地西泮组、酸枣仁汤组于每日7：30—8：30按 350 mg /kg以 10 mL /kg 腹腔注射给药，1次/d，持续3 d。对照组在相同时间腹腔注射等量生理盐水。

注射完成后，大鼠造模成功的标志为其出现昼夜节律消失，白昼不停活动，出现不安、躁动等表现[11]。

1.2.4 治疗给药

造模成功后，于造模结束后第2 d开始每日8:00给药，连续给药14 d，给药的浓度、剂量根据人与大鼠体表面积换算公式计算。酸枣仁汤组按体表面积法换算成大鼠的等效剂量50 g/kg，按照每只大鼠10 mL/kg每日行灌胃给药；地西泮组按体表面积法换算为1 mg/kg，按照每只大鼠10 mL/kg每日例行灌胃;模型组和空白组根据换算方法给予等体积生理盐水每日例行灌胃。

1.3 大鼠行为、情绪评价

1.3.1 旷场实验

所有大鼠于造模结束后一天, 先让其适应实验室内安静照明环境1 h后，将其放置于旷场实验箱正中央, 实验箱正上方摄像头及相关视频跟踪系统会记录大鼠5 min内的运动总距离、中心区停留时间以及进入次数[12]，追踪系统与电脑相连，有相关数据采集及分析系统。每只大鼠于实验结束后取出，并清理实验箱一次, 用75%的酒精擦拭实验箱防止气味等因素干扰。

1.3.2 高架十字迷宫实验

1.4 检测指标

1.4.1 单胺类神经递质含量测定

脑内单胺类神经递质主要包括去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-HT及其代谢产物。首先按照1. 0 mL/kg体质量注射剂量给各组大鼠腹腔注射质量分数为3%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉，麻醉成功的指标为注射后仰卧位翻正反射且无疼痛反应。麻醉成功后用提前经过消毒处理的手术器械剖开大鼠腹腔，分离前面的脏器及脂肪，找到腹主动脉，用一次性真空采血管取动脉血。取血后室温静置1 h，然后用离心机3000 r/min离心10 min，离心完成后分离上层纯净透明的血清[14]，制成样本液。用大鼠雌二醇(E2)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒依次经过标准品的稀释、温育、配液、洗涤、温育、洗涤、显色、终止、测定等步骤测出各孔的吸光度，再根据试剂盒中的说明书计算出NE、DA、5-HT的含量。

1.4.2 氨基酸类神经递质检测

氨基酸类神经递质包括Glu、GABA等。最后一次给药处理后30 min内处死并参照1.4.1节单胺类神经递质检测中腹主动脉取血、离心的步骤用ELISA法测定吸光度，根据试剂盒使用说明计算出Glu、GABA的含量。

1.4.3 血清中炎症相关因子TNF-a、 IL-1β、 IL-10含量检测

最后一次给药处理后30 min抽取大鼠腹主动脉的血液，静置，离心机3000 r /min 离心 10 min，分离出上层纯净的血清，制成样本液，采用ELISA法吸附测定检测血清中炎症相关因子TNF-α、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为、情绪评价结果

2.1.1 旷场实验结果

与空白组相比，PCPA诱导的失眠大鼠在旷场实验中总距离显著降低(P<0.05)，中央区域的进入次数与持续时间降低不明显(P>0.05)，见表1。各组的旷场实验轨迹图对比见图1，图中结果显示，与空白组相比，模型组大鼠在旷场实验中的总距离明显减少，酸枣仁汤治疗后大鼠在旷场实验的总距离和中央区域进入次数较模型组增加。

表1 空白组与模型组大鼠的旷场实验结果Table 1 Results of open-field experiment in model or control group

注：为方便计算大鼠进入中央区域的次数和停留时间，将旷场平均划分为九个区，其中最中间的区域为中央区域。图1 各组大鼠的旷场实验活动轨迹图Fig.1 Activity-tracking graph of open field experiment in each group

2.1.2 高架十字迷宫实验结果

与空白组相比，PCPA诱导的失眠大鼠在高架十字迷宫实验中其开臂停留时间百分比toc和进入开臂次数百分比Noc均有所降低，其中toc降低比较显著(P<0.05)，而Noc降低不明显(P>0.05)，见表2。各组的高架十字迷宫活动轨迹图对比见图2。图中结果显示，与空白组相比，模型组大鼠进入开臂的次数明显减少，酸枣仁汤治疗后大鼠进入高架十字迷宫开臂的次数较模型组增加。

表2 空白组与模型组大鼠的高架十字迷宫实验结果

注：在上述高架十字迷宫图中，a、c两臂(横臂)为封闭臂，b、d两臂(纵臂)为开放臂。图2 各组大鼠的高架十字迷宫实验活动轨迹图Fig.2 Activity-tracking graph of elevated plus-maze experiment in each group

2.2 检测指标结果

2.2.1 单胺类神经递质含量测定结果

与空白组相比，模型组5-HT含量显著降低(P<0.05)，DA含量显著升高(P<0.05)，NE含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，酸枣仁汤组5-HT含量显著升高(P<0.05)，DA含量显著降低(P<0.01)；而NE含量升高不明显(P>0.05)，见表3。

表3 各组单胺类神经递质含量Table 3 Monoamine neurotransmitter levels in each group

2.2.2 氨基酸类神经递质检测结果

与空白组相比，模型组Glu含量显著升高(P<0.05)，GABA含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，地西泮组和酸枣仁汤组Glu含量显著降低(P<0.01)，GABA含量均显著升高(P<0.01)，见表4。

表4 各组Glu、GABA含量

2.2.3 血清中炎症相关因子TNF-a、 IL-1β、 IL-10含量检测结果

与空白组相比，模型组TNF-α、IL-1β含量显著升高(P<0.01)，IL-10含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，地西泮组TNF-α显著降低(P<0.01)，酸枣仁汤组升高不明显；地西泮组、酸枣仁汤组IL-1β含量显著降低(P<0.01)，IL-10含量显著升高(P<0.01)，见表5。

表5 各组血清中炎症相关因子含量

3 讨论

本实验采用了国内外大多数学者比较认同的PCPA失眠模型[15]，并采用了旷场实验、高架十字迷宫实验进行模型的行为学评估。欧阳俊彦等[16]根据旷场实验结果认为，焦虑大鼠中央区域停留时间明显减少，而且其总的运动距离无显著性；张鹏横等[17]则认为焦虑水平高的动物会更倾向于停留在四周的区域，而焦虑水平低的大鼠对中央区域的探究次数和时间会比较多。高架十字迷宫实验是用来考察大鼠焦虑状态的常用考量工具，主要是利用了大鼠对新鲜环境的好奇、探究的天性和对高悬的开放臂的恐惧心理形成的矛盾冲突。李宁等[18]指出在该项目中,对于有焦虑的动物来说，其Noc和toc会明显降低,而经典抗焦虑药物则使两者升高。失眠大鼠在失眠的同时通常会伴有焦虑等症状，后期随着失眠程度加重可能会出现抑郁等其他症状。实验结果显示，造模后的大鼠相比于空白组，其旷场实验运动总距离明显降低，中央区域的进入次数与持续时间降低，但是降低不明显；而高架十字迷宫的结果则显示其toc和Noc均下降，其中toc下降比较显著。旷场实验中大鼠对中央区域的探索情况一定程度上表现了大鼠的焦虑水平，高架十字迷宫中大鼠对开臂的探索在一定程度上表现了大鼠好奇度及对未知外界环境的兴趣，本实验得出的结果说明造模后的大鼠相比于空白组的大鼠来说，其对中央区域的探索度降低，在旷场中运动度明显减少，有一定的焦虑症状出现，导致其对环境的兴趣和探索降低，这与临床中多数失眠患者出现焦虑，对事物好奇心、探索度降低有相似之处。

黎发根等[19]认为中药治疗失眠的作用机制可能有以下几种:一是中药中蕴含的某些有效成分通过调节抑制性神经递质(5-HT、GABA)等及兴奋性神经递质(如Glu、NE、DA等)的含量来治疗失眠;二是通过影响某些炎性细胞因子如IL-1、TNF-α等和某些睡眠相关因子来影响失眠;三是通过改善大脑皮层或者中脑中缝背核中的某些中枢神经超微结构来改善失眠。林腊梅[20]根据实验结果得出酸枣仁汤治疗失眠可能是通过调节脑内的单胺类神经递质与Glu神经递质的含量来实现的。 王慧等[11]在实验探究PCPA 失眠模型作用机制中5-HT 与Glu递质系统的关系时，认为酸枣仁汤可能是通过干预脑内代谢型Glu受体的mRNA及其受体后信号分子cAMP和PKA mRNA的表达来改善5-HT合成障碍，进而干预改善失眠。李家豪等[21]经过实验认为酸枣仁汤能够有效调节老年睡眠剥夺大鼠的昼夜节律，并提出酸枣仁汤改善睡眠的作用机制可能与其能调节大鼠5-HT及其受体的表达有关。现代研究已经证明某些细胞因子与调控睡眠的觉醒周期有关，如助眠因子白介素1(IL-1)、TNF-α、IL-6；而另一些炎性因子可能会通过影响慢波睡眠进而导致失眠，如IL-1β、白介素4(IL-4)、IL-10；石皓月等[22]在分析整理中药对PCPA失眠模型的作用时、提出由中药调节的睡眠作用机制可能与机体内炎性因子浓度改变或者炎症相关。

本实验研究了单胺类神经递质、氨基酸类神经递质、炎性相关因子与失眠治疗的关系，以此来推测酸枣仁汤治疗失眠可能存在的机制。所研究的单胺类神经递质主要包括NE、DA、5-HT，氨基酸类神经递质主要包括Glu、GABA。实验结果表明，与模型组相比，酸枣仁汤组5-HT、GABA含量显著升高，而NE含量升高但不明显； DA、Glu含量显著降低。说明酸枣仁汤可能是通过增加抑制性神经递质(如5-HT、GABA)，减小兴奋性神经递质(如DA、Glu)的含量来治疗失眠的，本实验中NE含量升高，但不具有统计学意义，可能受多种因素影响，后期有待于进一步研究。通过分析炎性细胞因子含量的变化，酸枣仁汤组对比模型组促炎性细胞因子IL-1β含量显著降低，抗炎性细胞因子IL-10含量显著升高，说明酸枣仁汤可能通过调节促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的水平来进一步缓解失眠。与地西泮组相比，DA和TNF-α有差异，且差异具有统计学意义，其中酸枣仁汤组DA含量降低更加显著，地西泮组TNF-α显著降低；而5-HT、GABA、NE、Glu、IL-1β、IL-10含量变化趋势相同，且无显著差异。说明酸枣仁汤与地西泮治疗失眠的作用机制可能存在相似性，均可以通过调节抑制性神经递质和兴奋性神经递质的含量、调节炎性细胞因子的含量来治疗失眠。而西药地西泮的主要作用机制可能是通过影响参与Glu转化为GABA的主要代谢酶GAD的表达来促进GABA与GABA-α受体的结合，从而产生抑制效应，进而起到镇静催眠的作用[23]。本实验结果则表明了酸枣仁汤组与地西泮组对某些指标的含量的改变略有不同，说明其作用机制可能也存在差异。

本实验研究发现，通过腹腔注射PCPA造模成功的失眠大鼠在造模后一定程度上出现焦虑现象，这与临床上某些失眠人群出现焦躁不安的现象比较相似。酸枣仁汤在治疗失眠方面的作用机制可能与其能增加抑制性神经递质和降低兴奋性神经递质的含量、调节炎性细胞因子的水平有关，酸枣仁汤与地西泮的作用有一定的相似之处。本实验着重研究了单胺类神经递质、氨基酸类神经递质、炎性相关因子与失眠治疗的关系，实验结果表明酸枣仁汤可以通过增加5-HT、GABA，减小DA、Glu含量，调节炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-10来治疗失眠。