小黑药茎叶提取液对亚硝化反应的清除和阻断作用

张鸭关，赵红艳，徐 玲，李梦丽

(1.曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011；2.保山学院高黎贡山生物资源研究所，云南 保山 678000；3.宣威市第十中学，云南 宣威 655400)

【研究意义】全世界每年大概有500万人被癌症夺去生命。在一系列致癌物中，目前最强的致癌物之一就是N-亚硝胺(NDMA)，它可以使人体和动物多种器官病变成恶性肿瘤，特别是肝癌、胃癌及食道癌，其致癌机理是亚硝胺形成的前驱体亚硝酸盐和胺在人体和动物的胃液环境下，可迅速进行亚硝化反应生成亚硝胺化合物[1-2]。在一系列酶的作用下，亚硝胺产生可使核酸烷化的亲电子烷基自由基，可使细胞遗传突变从而显示致癌性。因此，清除人体内合成亚硝胺的前体物质亚硝酸盐或阻断亚硝胺在人体内的合成是防癌抗癌的有效途径[1-2]。【前人研究进展】许多天然活性成分如还原糖、谷胱甘肽、VC、VE、有机硫化物及茶多酚等都具有清除亚硝酸盐、抑制N-亚硝胺合成的功效。这些天然活性成分广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中。有研究表明，许多植物提取液都能有效抑制亚硝胺在人体内合成，如吴茱萸、甘草、红豆多肽、荸荠皮、杜仲、原花青素、簕菜茶、牡荆、银杏叶、鹅绒藤、黄花菜等[2-11]。小黑药(InulanervosaWall.)为伞形科草本植物，是一种药食兼用的野生药用植物资源，自身具有特异的辛香气味，根、茎、叶皆可入味入药，其根、茎叶可以像蔬菜一样烹饪[12]。研究表明小黑药含有丰富的香豆素、三萜类糖和皂苷、氨基酸、维生素C、维生素E等生理活性物质[13-14]。民间常用小黑药治疗肺结核、肾虚腰痛、头晕等许多疾病，长期服用还可增强机体抵抗力[12]。【本研究切入点】当前，如何清除人体内合成亚硝胺的前体物质亚硝酸盐或阻断N-亚硝胺在人体内合成，已成为国内外研究学者普遍关注的问题。迄今为止，关于小黑药对亚硝化反应的抑制作用或清除致癌的前体物亚硝酸盐的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】在体外模拟人体胃液的条件下，通过紫外分光光度法研究小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除和亚硝胺的阻断作用，探究提取时间、固液比、温度和浓度对亚硝化反应的抑制作用的影响，并确定最佳提取条件，以期为筛选并开发安全、高效的亚硝化反应抑制剂和防癌抗癌天然功能食品，以及为小黑药的进一步开发与利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小黑药于2018年11月采自云南省沾益区，将采集到的小黑药清洗干净，将其茎叶与根分开，恒温干燥箱中于105 ℃烘干，粉碎过40目筛后，置于干燥器中备用，于2019年5月开始试验。

主要试剂：蒸馏水；去离子水；亚硝酸钠(AR)；二甲胺溶液(AR)；碳酸钠(AR)；无水乙醇(AR)；对氨基苯磺酸(AR)；α-萘胺(AR)；N-1一萘乙二胺盐酸盐(AR)；柠檬酸钠(AR)，盐酸(AR)；二甲胺(AR)。

主要仪器：分析天平(美国奥豪斯公司生产)；恒水浴温震荡器(常州国华电器有限公司生产)；离心机(上海安亭科学仪器厂生产)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司生产)；循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司生产)；数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司生产)；暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂生产)。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 以乙醇为浸提剂，研究在不同条件下，小黑药茎叶提取液亚硝酸盐清除率的变化趋势。试验初始条件设置为浸提温度25 ℃，浸提时间0.5 h，浸提剂浓度为25%，固液比为1∶10，单因素试验的试验水平设置见表1。

1.2.2 正交试验 为系统考察小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐清除的最佳提取条件，在单因素试验基础上，采用正交试验设计选择最优条件，以浸提时间、浸提温度、浸提剂浓度、固液比作为考察因素。以提取液对亚硝酸盐清除率作为考察指标，选用L9(34) 正交试验(表2)。

表1 单因素试验水平设置

表2 正交实验因素水平设置

1.2.3 优化实验 对正交实验结果进行极差分析，从而确定理论最佳浸提工艺条件，再通过优化实验进一步验证理论最佳浸提工艺条件是否与优化实验结果相一致，从而获得小黑药茎叶提取液的最佳浸提条件。

1.2.4 亚硝酸盐清除率的测定原理 通过对亚硝酸盐和氨基苯磺酸进行重氮化反应，然后用N-1萘乙二胺盐酸盐合成红色化合物。在弱酸性的条件下，取小黑药提取液2.0 mL于25 mL比色管中，加入pH 3.0的缓冲液12.5 mL及NaNO2溶液(100 mg/kg)2.5 mL，最后用蒸馏水定容至25 mL，在37 ℃条件下恒温加热2.0 h，用移液器移取1.0 mL样液于小试管中，再往小试管中加入质量分数为0.4%对氨基苯磺酸溶液2.0 mL，以及质量分数为0.2%N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液2.0 mL，摇匀后放置15 min，用紫外-可见分光光度计测定吸光度，测定波长为540 nm，用相应浓度相应用量的提取剂作对照试验，清除率计算公式：

清除率(%)=(A0-Ax)/A0×100

(1)

其中，A0：空白对照实验的吸光度；Ax：不同提取液时的吸光度。

1.2.5 N-亚硝胺合成阻断率的测定 于体外模拟人体胃液的试验条件，二甲胺与亚硝酸钠在pH 3.0的缓冲液中，恒温37 ℃条件下，会生成二甲基亚硝胺(NDMA)物质。

(CH3)2NH + NaNO2→ (CH3)2N-N=O + HCl + H2O

(2)

将二甲胺和亚硝酸钠加入小黑药茎叶提取液时，提取液中的活性物质首先与亚硝酸钠作用，阻断二甲胺和亚硝酸盐反应生成亚硝胺。亚硝胺的含量越大，则表明提取液的阻断率越小，反之则亦强。亚硝胺可以在紫外线下分解:

(3)

图1 浸提时间对亚硝酸盐清除率的影响Fig.1 The effect of extraction time on the scavenging rate of sodium nitrite

对氨基苯磺酸和亚硝酸盐进行重氮化反应，然后用N-1萘乙二胺盐酸盐合成红色化合物。用分光光度法测定反应液中亚硝胺的含量，确定化合物的吸光度值。在25 mL的比色管中加入5.0 mL提取液，再加入12.5 mL的柠檬酸钠缓冲液，1.25 mL NaNO2；1.25 mL二甲胺，蒸馏水定容。在37 ℃恒温1 h，从有1.0 mL反应液体的小管，加入0.5 mL质量分数为5%的Na2CO3溶液，于紫外分析仪下照射15 min，紫外灯和小试管液面的距离为15 cm，取出后往小试管中加入1.5 mL质量分数0.1%的对氨基苯磺酸溶液，再加入1.5 mL质量分数为0.1%的α-萘胺，最后再加0.5 mL蒸馏水，静置15 min，在525 nm使用分光光度计测量吸光度。同时进行了空白对照实验。阻断率的计算公式如下:

阻断率(%)=(A0-Ax)/A0×100

(4)

其中，A0:未加样液时的吸光度值(以试剂空白溶液为参比溶液);Ax:加入样液后的吸光度值(以同浓度样液为参比溶液)。

2 结果与分析

2.1 提取条件的单因素试验

2.1.1 浸提时间对亚硝酸盐清除率的影响 由图1可知，不同浸提时间小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率不同。随着浸提时间的增加，小黑药浸提液对亚硝酸盐清除率坡度增加，在反应时间为0.5 h时，清除率仅为59.35%，当提取时间达到3.5 h时，清除率达到最大，达66.33%，随后继续增加时间，清除率又有降低的趋势。这可能是由于随着时间的延长，小黑药茎叶中的某些活性成分可能失去生理活性，使亚硝酸盐清除率下降。因此，初步确定正交试验小黑药茎叶浸提时间为3.0、3.5、4.0 h。

2.1.2 浸提温度对亚硝酸盐清除率的影响 由图2可知，不同浸提温度下，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率不同。随着提取温度的升高，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐清除率呈先增加后降低趋势，当浸提温度为25 ℃时，亚硝酸盐清除率46.19%，当控制水浴温度为65 ℃时，清除率达到最大为56.78%，随后有降低的趋势。这可能是因为随着提取温度的升高，反应物分子之间运动更加剧烈，分子之间的碰撞机率迅速增加。但是由于温度太高，小黑药活性成分可能会被分解，降低亚硝酸盐的清除能力。所以，初步确定正交试验小黑药茎液提取温度为55、65、75 ℃。

图2 浸提温度对亚硝酸盐清除率的影响Fig.2 The effect of temperature on the scavenging rate of sodium nitrite

图3 浸提剂浓度对亚硝酸盐清除率的影响Fig.3 The effect of concentration of extractant on the scavenging rate of sodium nitrite

2.1.3 浸提剂浓度对亚硝酸盐清除率的影响 由图3可知，浸提剂浓度不同，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率不同。随着浸提剂的浓度的增加，小黑药提取液对亚硝酸盐的清除率呈先增加后降低趋势。当提取剂浓度为25%时，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率为48.26%，当提取剂浓度增加到35%时，清除率达到最大值50.20%，随着提取剂浓度的进一步升高小黑药提取液对亚硝酸盐的清除率持续降低。因此，初步确定正交试验小黑药叶茎提取浓度为25%、35%、45%。

图4 固液比对亚硝酸盐清除率的影响Fig.4 The effect of solid-liquid rate on the scavenging rate of sodium nitrite

2.1.4 固液比对亚硝酸盐清除率的影响 由图4可知，固液比不同，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率不同。随着固液比的上升，小黑药提取液对亚硝酸盐的清除率呈先增加后降低趋势。当固液比为1∶10时，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率为25.95%，当提取液的固液比增大到1∶20时，清除率达到最大值，为38.04%。随后随着固液比的提高，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率持续降低。因此，初步确定正交试验小黑药茎叶提取固液比为1∶15、1∶20、1∶25。

2.2 L9(34)正交试验

由表3可知，考察指标为亚硝酸钠清除率的时候，小黑药茎叶的最佳提取因素组合为C2B2A2D1，即用25%的乙醇水溶液，在固液比为1∶20、温度为65 ℃、提取时间为3.0 h的条件所得的小黑药茎叶提取液对亚硝酸钠的清除效果表现最好。通过极差分析，各因素对实验结果的影响顺序为：温度﹥固液比﹥时间﹥提取剂浓度，即提取温度对小黑药茎叶提取液的亚硝酸盐清除率影响最大，而提取剂提取浓度影响最小。

表3 正交试验结果

2.3 优化实验

以正交实验得出的理论最佳提取因素组合C2B2A2D1为提取条件，进行小黑药茎叶提取液的提取，进而考察小黑药提取液清除亚硝酸盐实际效果，结果表明，在理论最佳提取条件下，小黑药茎叶提取液对亚硝酸盐的清除率为68.26%，其大于正交试验中的所有清除率。因此，小黑药茎叶提取液最佳提取条件为C2B2A2D1，即提取时间为3.0 h，固液比为1∶20，温度为65 ℃，提取剂浓度为25%时最佳。

2.4 不同用量的小黑药提取液对阻断亚硝胺(NDMA)生成的影响

在最佳浸提条件(C2B2A2D1) 下获得的浸提液，研究不同用量的小黑药茎叶提取液对阻断亚硝胺生成的影响，结果如图5所示。由图5所知，不同用量的小黑药茎叶提取液对NDMA阻断率的影响不同，随着小黑药茎叶提取液用量的增多，对亚硝胺(NDMA)的阻断率呈先增加后降低再趋于稳定的趋势。当浸提液用量为2.0 mL时对亚硝胺(NDMA)的阻断率达到峰值，此时小黑药茎叶提取液对亚硝胺的阻断率为85.22%。

由图5所知，不同用量的小黑药茎叶提取液对NDMA阻断率的影响不同，随着小黑药茎叶提取液用量的增多，对亚硝胺(NDMA)的阻断率呈先增加后降低再趋于稳定的趋势。当浸提液用量为2.0 mL时对亚硝胺(NDMA)的阻断率达到峰值，此时小黑药茎叶提取液对亚硝胺的阻断率为85.22%。

3 讨 论

许多天然源植物提取物对亚硝酸盐的清除与亚硝胺合成的阻断都具有一定的效果。本试验也表明，模拟人体胃液条件下，小黑药茎叶乙醇提取液对亚硝酸盐的清除效果较好，可有效阻断亚硝胺的合成。在单因素试验研究中发现，小黑药茎叶粗提取液随着乙醇浓度的升高对亚硝酸盐清除率呈先升高后降低趋势，且乙醇浓度为35%时清除率最大。究其原因可能是乙醇渗透能力强，低浓度乙醇进入细胞后使得细胞膜的通透性增加，从而导致胞内物质浸出，而当乙醇浓度过高时，细胞表面的蛋白质变性凝固，导致细胞膜的通透性降低，使得胞内物质浸出率下降。因此，只有当乙醇与水以一定比例混合时，才能达到最高的提取率。本研究表明，当乙醇浓度为35% 时，萃取的活性成分含量最高，对亚硝酸盐的清除效果最佳。

图5 不同用量的小黑药茎叶提取液的NDMA阻断率Fig.5 Capabilities of disconnecting NDMA by Inula nervosa wall extracts(under C2B2A2D1 condition)

4 结 论

(1)在体外模拟胃液，即 pH为 3.0，37 ℃的条件下，小黑药茎叶提取液可有效清除亚硝酸盐及阻断NDMA的生成。通过L9(34)正交实验，经极差分析以及优化实验，最终获得对小黑药茎叶中活性成分的最佳浸提条件是：浸提剂浓度为25%，固液比为1∶20、温度为65 ℃，提取时间为3.0 h。此条件所得的小黑药茎叶提取液对亚硝酸钠的清除效果最好，为68.25%；当提取液用量为2.0 mL时，对亚硝胺(NDMA)的最大阻断率达到最大值，为85.22%。

(2)小黑药作为药食两用的野生药用植物资源，广泛分布于云南、贵州、广西等地，人们更多时候是利用其根，而茎叶往往作为废弃资源丢弃，给小黑药的利用造成了极大的浪费。试验表明小黑药茎叶提取液可有效阻断NDMA 的合成和清除亚硝酸盐，本研究为小黑药作为防癌抗癌功能食品以及进一步开发利用提供了一定的理论依据。