化肥减量配施有机肥对田烟根际土壤细菌群落多样性的影响

刘 魁，杨亚丽，杨继周，王正旭，田阳阳，杨博凯， 严 杰，吴 昊，赵文军*

(1.红塔烟草(集团)有限责任公司，云南 玉溪 653100；2.玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100；3.云南省烟草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100)

【研究意义】土壤是烤烟赖以生长的环境基础，而土壤微生物是土壤中的重要组成成分，参与土壤生态系统中的物质循环和能量转换，是衡量土壤健康状况及生产力的重要指标之一[1]。但目前由于烤烟生产上化肥的长期大量施用，造成植烟土壤板结，微生物群落结构改变，养分利用率不高，限制了烟叶质量的提升[2]，特别是长期种植蔬菜作为烤烟前茬作物的田烟区域，土壤处于亚健康状态，养分含量偏高，酶活性和微生物数量下降，病害加重[3]。因此，蔬菜接茬烟田土壤的修复是十分必要的。施用有机肥是目前常用的土壤改良措施之一，有利于增加土壤微生物数量及其代谢活性，改善土壤健康水平[4]。因此，研究有机肥与化肥配施对田烟土壤微生物区系的影响，对烟区土壤改良及可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，关于有机无机肥配施对田烟土壤微生物的影响，前人已做了大量研究。张晓海等[5]研究表明，施用菜籽饼有利于增加田烟土壤细菌数量，提高了烤烟生长中后期根际解磷细菌和解钾细菌的数量；彭智良等[6]施用饼肥和腐殖酸有利于提高烟田土壤细菌数量及生育中后期放线菌数量；王彦锟等[7]连续3年施用有机肥明显提高了黄壤烟田土壤微生物碳氮、微生物熵及微生物呼吸强度。【本研究切入点】目前田烟生产上有机无机肥配施效果的研究多侧重于土壤养分、土壤微生物数量及烟叶质量的影响，而对田烟根际土壤微生物群落多样性及结构组成研究报道较少。【拟解决的关键问题】以烤烟前茬长期种植蔬菜的田烟土壤为对象，利用高通量测序平台研究等氮条件下化肥减量配施有机肥对根际土壤细菌群落多样性及结构组成的影响，以期为改良烟区土壤环境提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地土壤状况及试验材料

试验于2019年在云南省玉溪市江川县前卫镇周官村进行，试验土壤pH 6.6，有机质含量为27.3 g/kg，全氮含量为2.1 g/kg，水解性氮含量为182.2 mg/kg，速效钾含量为421 mg/kg，有效磷含量为105.2 mg/kg，土地类型为田烟，烤烟前茬作物为蔬菜。供试化肥为烟草专用复合肥，N∶P∶K=12∶6∶24；供试有机肥理化性质为pH 5.9，有机质90.8%，全氮0.90%，碳氮比58.5。供试烤烟品种为K326。

1.2 试验设计

按照有机肥与化肥氮含量在总施氮量中的占比折算各肥料施用量，确保各处理总氮用量相等，均为54 kg/hm2。试验设置4个处理：CK(100%化肥N)；T1(20%有机肥N+80%化肥N)；T2(40%有机肥N+60%化肥N)；T3(60%有机肥N+40%化肥N)。随机区组设计，3次重复，12个小区，小区面积为50 m2，设置保护行，行株距为1.20 m×0.50 m。每个处理有机肥均做基肥拌塘施用，其他田间栽培技术按2019年玉溪市烟叶标准化生产技术方案执行。

1.3 样品采集

烤烟移栽后55 d，每个处理随机挖出10株健壮无病烟株根系，抖掉烟株根系附近较大土壤团块并收集附着在根系表面的土壤，混合为1个样品，过20目筛，去除根、动物残骸以及其他杂质后装入无菌离心管，置于-80 ℃超低温冰箱冷冻保存，待测。

1.4 测定方法

1.4.1 土壤酶活性的测定 参照关松荫[8]的方法测定烤烟根际土壤样品中过氧化氢酶、蔗糖酶及脲酶活性。

1.4.2 DNA提取和PCR扩增 用MO-BIO PowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒提取各处理土壤样品DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度后进行PCR扩增，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后回收进行上机测序。PCR扩增引物序列为细菌16S rDNA V4区特异引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，测序系统采用Thermofisher公司的Ion S5TMXL测序平台，测序公司为北京诺禾致源科技股份有限公司。

1.4.3 数据处理与分析 使用FLASH v1.2.7[9]软件对每个样本截去标签序列和引物序列的reads进行拼接，经严格过滤[10]后去除嵌合体序列得到最终有效序列，在97%相似性水平上使用Uparse v7.0.1001软件将全部有效序列聚类成OTUs，即操作分类单元。用Mothur方法与SILVA的数据库[11]进行物种注释分析，并统计在各个分类水平上的土壤样本细菌群落结构组成。最后以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理后分析数据。使用Qiimev1.9.1软件计算Shannon、Chao1、ace等α多样性指数及Unifrac距离，构建UPGMA样品聚类树，使用Rv2.15.3软件绘制稀释性曲线、PCA图，使用Microsoft excel 365绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对田烟根际土壤酶活性的影响

由表1可知，根际土壤过氧化氢酶活性T1处理显著低于CK，T2、T3处理与CK无显著差异(P>0.05)。脲酶和蔗糖酶活性T1处理与CK无显著差异(P>0.05)，T2和T3处理显著高于CK和T1处理(P<0.05)。可见，T2、T3处理有利于提高田烟根际土壤脲酶和蔗糖酶活性。

2.2 田烟根际土壤细菌群落α多样性分析

4个处理土壤样本经测序并去除嵌合体后共获得有效序列237 913条，按97%一致性共聚类为5719个OTUs，注释到3界42门53纲124目245科569属405种(含未明确细菌)。由表2可知，样品测序深度系数Goodscoverage为99.35%～99.72%，表明各土壤样品文库均涵盖了99.35%以上的细菌类群，能够反映出土壤样本中真实的细菌群落结构组成及分布特征。各处理OTU数量、Shannon指数、Chao1指数和ace指数均表现为T1>T2>CK>T3。可见，T1、T2处理有利于提高田烟根际土壤细菌群落多样性和丰富度。

2.3 田烟根际土壤细菌群落在门水平上的结构组成分析

对不同处理根际土壤优势细菌门的分析表明(图1)，排名前10的优势细菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、未明确细菌(unidentified Bacteria)，总的相对丰度达到95.24%～97.91%，基本反映各样品中细菌群落组成情况。其中，变形菌门相对丰度随着有机肥N用量的增加呈增加趋势，CK、T1、T2、T3处理相对丰度依次为41.94%、48.49%、49.06%、54.69%；放线菌门和厚壁菌门相对丰度以T2处理最高；酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰度以T1处理最高，但是各处理拟杆菌门相对丰度较CK均有所降低。

2.4 田烟根际土壤细菌群落在属水平上的结构组成分析

优势细菌属排名前10的相对丰度见图2。罗思河小杆菌属(Rhodanobacter)、Dyella属、unidentifiedGammaproteobacteria属及卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella)相对丰度均表现为T3>T2>T1>CK；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘脂菌属(Sphingobium)相对丰度均随有机肥用量的增加呈现出先增后减的趋势，以T2处理最高；Salinimicrobium属和Pontibacter属相对丰度T1、T2、T3处理较CK均有所下降；类诺卡氏属(Nocardioides)除T2处理高于CK外，其余处理均有所降低。

2.5 田烟根际土壤细菌群落相似性分析

田烟根际土壤细菌群落组成及相对丰度不同处理的主坐标分析结果见图3。对样本差异的贡献值第一主成分为46.79%，第二主成分为37.92%，合计贡献值为84.71%。从样品分布来看，T1和T2处理处于坐标系第三象限，CK、T3处理分别处于坐标系第四、第一象限，其中T2处理与CK距离最远，表明化肥减量配施有机肥能改变土壤细菌群落结构。UPGMA聚类结果表明(图4)，T1与T2处理聚为一类，T3与CK分别各为一类，说明T1与T2细菌群落丰度相似性较高。显示，化肥减量配施有机肥后，田烟根际土壤细菌群落结构组成较单施化肥均发生了明显变化，其中以化肥减量配施40%有机肥对田烟根际土壤细菌群落结构组成的影响最大。

表1 不同处理对烤烟根际土壤酶活性的影响

表2 烤烟根际土壤细菌群落α多样性指数

图1 门水平上烤烟根际土壤主要优势细菌及其相对丰度Fig.1 Main dominant bacteria and their relative abundance in tobacco rhizosphere soil at pyhlum level

图2 属水平上烤烟根际土壤主要优势细菌及其相对丰度Fig.2 Main dominant bacteria and their relative abundance in tobacco rhizosphere soil at genus level

图3 烤烟根际土壤细菌群落的PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of bacterial community in tobacco rhizosphere soil

3 讨 论

3.1 不同处理对田烟根际土壤酶活性的影响

土壤酶活性是反映土壤肥力的重要指标，与微生物共同推动着土壤的代谢活动，参与土壤中多种生物化学过程和物质循环[12]。张长华等[13]研究表明，有机无机肥配施可显著提高植烟土壤脲酶和蔗糖酶活性。通过试验，化肥减量配施40%～60%有机肥可显著提高田烟根际土壤脲酶和蔗糖酶活性，这是因为有机肥的施入增加了土壤中有机氮和有机碳含量，从而促进了酶促反应来调节土壤养分。

图4 烤烟根际土壤细菌群落在门水平上的UPGMA聚类分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of bacterial community in tobacco rhizosphere soil at phylum level

3.2 不同处理对田烟根际土壤细菌群落多样性指数的影响

在微生物多样性研究中，Shannon指数越大，微生物群落均匀度越高；Chao1和ace指数越大，微生物群落的丰富度越高[14]。研究结果表明，Shannon、Chao1和ace等多样性指数均随着有机肥施用量的增加呈现先增后减的趋势，刘昌等[15]研究也有类似结果。这种趋势符合“connell中度干扰假说”，即生态系统处于中等程度干扰时，物种生存机会最多，群落多样性最高[16]。

3.3 不同处理对田烟根际土壤优势细菌门群落多样性的影响

通过研究，变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、酸杆菌门及芽单胞菌门为主要优势细菌门类，韦俊等[17]研究也有类似结果。不同处理根际土壤优势细菌门相对丰度有所差异，这是有机肥不同用量对土壤理化性质造成的影响差异所致，土壤理化性质是细菌群落结构变化的重要驱动力[18]。各处理土壤中变形菌门相对丰度最高，且随着有机肥用量的增加呈增加趋势，马晓英等[19]研究也有相同结果。可见，土壤中有机物质的增加有利于提高变形菌门的相对丰度。这是由于变形菌门许多细菌具有共生性，并与土壤中有机物质密切相关，倾向生长于营养丰富的土壤中[20]，而有机物质的输入为变形菌门中异养型微生物提供了碳源，促进了该类细菌的生长繁殖。

3.4 不同处理对田烟根际土壤优势细菌属群落多样性的影响

微生物在土壤碳氮循环及土壤修复等方面具有十分重要的作用。如Rhodanobacter属对氮代谢具有重要作用[21]，Dyella属可用于联苯污染土壤的生物修复[22]，Sphingomonas属具有降解芳香化合物和固氮功能[23]。化肥减量配施有机肥处理较单施化肥均提高了田烟根际土壤中Rhodanobacter属、Dyella属及Sphingomonas属细菌相对丰度。显示，化肥减量配施有机肥能够提高某些特定微生物的相对丰度。Rhodanobacter属相对丰度的变化是由于有机肥(pH=5.9)的酸性特点促进了该类细菌在土壤中的富集，王晓彤等[24]研究认为，Rhodanobacter属细菌为耐酸菌，随着pH降低其相对丰度逐渐增加。Sphingomonas属细菌相对丰度的增加是由于该类细菌生长可利用芳香族化合物进行生长繁殖，而有机物质的输入有利于提高根际土壤芳香族化合物的含量[25]。对dyella属的研究目前多是分离鉴定和功能性的研究，其影响因素及机理尚待探讨[22]。

研究发现一类与土壤盐渍化相关的细菌属类，如Salinimicrobium属和Pontibacter属，这是由于烤烟和前茬作物长期大量施用化肥以及试验区近几年的干旱天气导致易溶性盐分在土壤中积累，进而促进耐盐性细菌的繁殖生长。Salinimicrobium属和Pontibacter属为嗜盐性细菌，土壤中相对较高的含盐量利于该类细菌的生长繁殖[26-27]。有研究显示施用有机肥处理Salinimicrobium属和Pontibacter属相对丰度均低于单施化肥处理，李玉等[28]利用有机肥替代部分化肥对滨海盐碱地土壤改良的研究也有类似结果。有研究表明施用有机肥卡斯特兰尼氏菌属的相对丰度均高于单施化肥处理，而该细菌属具有通过脱氮功能修复盐渍化土壤的功能[29]。可见，化肥减量配施有机肥有利于修复盐渍化土壤，改善土壤健康状况。

4 结 论

在等氮条件下，化肥减量配施有机肥有利于提高田烟根际土壤酶活性及细菌群落多样性，改善细菌群落结构组成，其中以化肥减量配施40%有机肥表现更优。