磷霉素与其他抗菌药物对多重耐药铜绿假单胞菌的联合药敏试验研究

刘云宁，李小凤，汤建华，张鹤鸣，刘金禄，刘晓明

(河北北方学院附属第一医院 1. 药学部； 2. 微生物科，河北 张家口 075000)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是医院感染常见的条件致病菌，当人体接受侵袭性操作、免疫力下降、具有慢性结构性肺病、长期应用广谱抗菌药物等情况时，常会导致感染[1]。2014—2019年全国细菌耐药监测网监测数据[2]显示，PA对亚胺培南的耐药率为18.2%～21.0%。 PA的耐药机制复杂，包括主动外排泵作用，产生抗生素水解酶和修饰酶，改变菌体细胞膜通透性以及染色体突变或捕获外源性基因盒获得耐药性等[3]，在常用抗菌药物中极易产生交叉耐药，并呈现多重耐药(multidrug resistance, MDR)或泛耐药(extensive drug resistance, XDR)的特征，增加临床治疗难度[4]。磷霉素(fosfomycin, FOS)是磷酸烯醇丙酮酸的类似物，对耐药的革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G-)菌均具有良好的抗菌活性，作用机制独特且与其他抗菌药物无交叉耐药[5]。研究以FOS为主，联合其他抗菌药物对PA的体外药敏试验，以期为临床治疗多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)感染提供合理的给药方案。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2018年1月—2019年12月某三甲医院50例不同住院患者标本无重复分离的50株(痰40株，分泌物7株，血3株)受试PA。菌株的分离、培养严格按照《全国临床检验操作规程》第4版进行。全部菌株均采用BD Phoenix 100全自动微生物鉴定/药敏分析仪鉴定，对于常见抗菌药物(包括头孢菌素类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂复合制剂、氟喹诺酮类和氨基糖苷类)中3类或3类以上的药物耐药，符合MDR-PA标准[1]。

1.2 药品与仪器 FOS购自中国药品生物制品检定所，葡萄糖-6-磷酸盐购自上海浦津生物科技有限公司，哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢他啶(CAZ)、美罗培南(MEM)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)药敏纸片均购自OXOID公司，BD-Phoenix 100全自动细菌鉴定仪。

1.3 试验方法 采用琼脂平板稀释法结合纸片扩散法，测定联合药物对PA的敏感性。严格按照《全国临床检验操作规程》(第四版)制备琼脂培养液(培养液含25 mg/L葡萄糖-6-磷酸盐)，在琼脂培养液中加入 FOS，制成含不同浓度 FOS的琼脂培养皿(50、100、150、200、250 μg/mL)。将同一株PA菌株接种到含不同浓度 FOS的琼脂培养皿中，并将联用抗菌药物的药敏纸片粘贴于培养皿上，置37℃培养箱培养24 h，由同一检验师用游标卡尺测量抑菌环。

1.4 统计分析 应用WHONET 5.6软件、SPSS 22.0软件进行耐药资料分析。相同药物与不同浓度FOS的组合，对PA的敏感性变化采用多个独立样本非参数检验中的多组秩和检验(Kruskal-WallisH)，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验菌株对抗菌药物的敏感性 试验筛选的50株MDR-PA均通过BD Phoenix 100全自动微生物鉴定/药敏分析仪进行复核，对TZP 2株中介，CAZ 2株中介，MEM 8株中介，AMK 6株中介，CIP 3株中介；对哌拉西林、氨曲南、头孢吡肟、左氧氟沙星均表现为耐药；多粘菌素对试验菌株的MIC≤1 μg/mL；此外2株试验菌株对庆大霉素表现为中介。

2.2 联合药敏试验结果 FOS 200 μg/mL组，TZP+FOS组敏感2株，中介5株，耐药43株，敏感率4.0%；CAZ+FOS组敏感6株，中介6株，耐药38株，敏感率12.0%；MEM+FOS组敏感30株，中介8株，耐药12株，敏感率60.0%；FOS+AMK组敏感7株，中介16株，耐药27株，敏感率14.0%；FOS+CIP组敏感29株，中介11株，耐药10株，敏感率58.0%。

分析FOS不同浓度含药平板分别联合5种抗菌药物的药敏结果，结果显示：FOS+TZP、FOS+CAZ在不同FOS浓度(50～250 μg/mL)组间均无协同作用(P>0.05)；FOS+MEM、FOS+AMK、FOS+CIP在不同磷霉素浓度(50～250 mg/L)组间均表现出协同作用(P<0.05)。FOS+MEM、FOS+CIP、FOS+AMK组合两两比较，FOS+MEM组合与FOS+CIP组合在所有剂量组中比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；在低剂量组(50、100 μg/mL)，FOS+AMK与FOS+MEM、FOS+CIP比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；在高剂量组(150、200 μg/mL)，FOS+AMK与FOS+MEM比较，差异存在统计学意义(χ2=9.032 5，P=0.003；χ2=9.4578，P=0.002)；在高剂量组(150、200 μg/mL)，FOS+AMK与FOS+CIP比较，差异存在统计学意义(χ2=11.6768，P=0.001；χ2=12.3981，P<0.001)。FOS+MEM组合、FOS+CIP组合比FOS+AMK组合更敏感。见表1。

表1 50株MDR-PA体外联合药敏试验结果

3 讨论

FOS是小分子亲水性抗菌药物，血浆蛋白结合率极低(2.16%)，静脉给药后几乎完全通过肾小球滤过消除(95%～99%)。静脉滴注 FOS 0.5、1.0、2.0、4.0 g后血药峰浓度分别为28、46、90、195 μg/mL。蒙特卡洛模拟显示，对于重症感染患者延长输注法(6g/q6h)可提高 Cmax并缩短 Tmax，且与其他抗菌药物有很好的协同作用[6]。 FOS持续输注(负荷剂量8 g，之后1 g/h)给药方案，其稳态浓度为(183.8±35.9)μg/mL[7]。Walsh等[8]体外研究显示， FOS可中等程度杀灭低接种量(最大杀灭3 log10 CFU/mL)的PA，但24 h后PA会再次生长，此时敏感菌株完全由耐药株取代，该研究结果与Rodríguez-Gascón等[9]的研究均提示, FOS不宜单药治疗PA感染。

PA的耐药机制复杂多变，其中生物被膜的形成可以使PA逃避机体免疫和抗菌药物的杀伤作用。Wang等[10]研究显示，FOS+CIP联合用药对PA生物膜清除的协同作用为57.1%。Yamada等[11]通过电子显微镜观察到，与单独用药相比， FOS联合CIP更易导致细胞膜溶解。Gómez-Garcés等[12]体外抗菌试验显示， FOS联合CIP对40%的CRPA具有协同作用，未见拮抗作用。

一项关于FOS+AMK联合吸入系统(AFIS)的研究发现，联合用药(AMK∶FOS为 5∶2)联合剂对PA的最低抑菌浓度(MIC)值较AMK和FOS单药的MIC值降低一半[13]。Sime等[14]研究呼吸机相关肺炎患者临床分离菌株发现，FOS单药对PA无任何抗菌活性，AMK 24 h内可产生较好的抗菌活性，但随后可快速产生耐药性，但二者联合用药可产生快速杀菌作用，同时有效抑制耐药菌株的产生。CRPA体外抗菌活性试验显示，FOS与AMK的协同杀菌率为12%[12]，无拮抗作用。

FOS联合碳青霉烯类抗生素可降低PA生物膜的形成，并降低其自发突变率。FOS联合MEM对PA的协同杀菌率为53.3%(8/15)[15]，对CRPA的协同杀菌率40.0%(28/70)[16]，且均未发现拮抗作用。Albiero等[17]对产生金属β-内酰胺酶(MBL)的PA进行体外抗菌试验，研究发现FOS联合MEM使得PA的MIC50和MIC90降低至1/8。Drusano等[18]研究显示，不同给药剂量的FOS联合MEM方案，均能够降低选择耐药性的出现(MEM突变体被联合杀伤，以及FOS突变体被联合杀伤)，研究结果表明，联合给药方案对于杀灭细菌细胞和抑制耐药菌株的出现均具有明显的协同作用。

本研究结果显示，FOS+MEM、FOS+AMK、FOS+CIP组合在FOS各剂量组合比较中均有差异(P<0.05)，敏感性增加，但在两两比较中FOS+MEM组合和FOS+CIP组合与FOS+AMK组合在FOS高剂量组(150、200 μg/mL)中均表现出统计学差异(P<0.05)，提示FOS+MEM组合和FOS+CIP组合对MDR-PA表现出较高的抗菌活性。结合FOS的药代动力学数据提示，FOS联合治疗MDR-PA感染时应给予较高的剂量。

FOS与TZP、CAZ联合用药方案的文献报道相对较少，Tessier等[19]研究显示，FOS与CAZ联合用药仅有20%的相加作用，80%无关。本研究结果显示，FOS+TZP组合与FOS+CAZ组合在FOS各剂量组合比较中，差异均无意义(均P>0.05)，敏感性无明显增加，与文献[19]报道一致，因此不推荐临床联合给药。

MDR-PA的治疗药物选择非常有限。本研究为FOS联合其他药物治疗MDR-PA提供了理论依据，但本研究数据较为有限，且研究结果仅显示药物体外敏感情况，联合用药的临床疗效有待进一步的临床研究证实，同时本研究中FOS发挥抗菌活性时给药剂量相对较高，临床应用过程中需要警惕FOS引起的静脉炎、高钠血症等不良反应。