白耙齿菌发酵茶体内降血脂及保护肝脏作用的研究

韦炎冶，姜明国，邓丽姚，刘 聪，高彩密，夏雨弘，刘洪存，陈林梦，杨立芳,

（1.广西民族大学海洋与生物技术学院, 广西多糖材料与改性重点实验室, 广西南宁530008；2.广西民族大学化学化工学院, 广西林产化学与工程重点实验室, 广西海洋微生物资源产业化工程技术研究中心, 广西南宁530008）

高脂血症是现代常见的代谢性紊乱疾病[1]，主要表现为胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量高于正常水平[2-3]。高脂血症会加速动脉粥样硬化[4]，造成供血不足、缺氧，肝脏也会受到损伤，如脂肪肝等[5-6]。高血脂症与遗传、饮食以及一些中间原发疾病等因素具有紧密联系[7]，其中饮食因素为大多数高血脂症的主要发病原因[8]。现代降血脂药物主要为他汀类药物，其降血脂作用机制清晰有效，但有一定的副作用，如使患者头痛、失眠、消化不良等症状，部分患者还会出现转氨酶升高、肌痛、横纹肌溶解等反应[9-11]。为了克服和减小这些不良反应，人们开始从天然药物、微生物中找寻能够治疗高血脂症的新型药物[12-13]。

白耙齿菌（Irpex lacteus），属担子菌门（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），皱孔菌科（Meruliaceae），耙齿菌属（Irpex）。目前耙齿菌属有4个种，包括鲑贝耙齿菌、绒囊耙齿菌、黄耙齿菌以及白耙齿菌，其中白耙齿菌具有较强生物活性[14]。白耙齿菌多糖有抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖的作用，以及治疗肾小球肾炎的功能[15]。有研究发现，白耙齿菌具有抗疲劳、降血糖、提高免疫功能以及治疗高尿酸血症和痛风性关节炎等作用[16-17]。此外，还有研究发现白耙齿菌次生代谢产物中具有结构新颖、活性良好的新化合物[18-19]。

茶叶属被子植物门（Angiospermae），双子叶植物纲（Dicotyledoneae），山茶目（Theales），山茶科（Theaceae），山茶属（Camellia）植物。茶叶含有许多活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶氨酸、咖啡碱等[20]。茶多酚具有抗氧化活性、调节糖脂代谢等作用[21-22]；茶多糖可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖[23]；茶氨酸能增强肝脏排毒功能[24-25]；咖啡碱能使中枢神经兴奋，达到抗疲劳、提升心脏机能等作用[26]。如何将具有较好活性的白耙齿菌进行驯化，使其能与茶叶共发酵培养，加工出具有茶和耙齿菌双重活性功效的新型功能菌茶，既可充分利用两种物质中对人体健康更有益的次生代谢产物，又可提升茶叶的品质和保健、养生功效，对于传统茶产品的升级和拓展具有十分重要的意义。

本试验研究白耙齿菌与茶叶共发酵培养，并采用高血脂小鼠模型，探索白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C以及 AST、ALT、ALP和抗氧化因子的影响，评价白耙齿菌发酵茶对高血脂症小鼠肝脏的保护作用，为食用药用真菌和茶叶开发提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级 KM 雄性小鼠 70 只，体重（20±2）g，广西医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证：SCXK（桂） 2014-0002；小鼠基础饲料 广西医科大学动物实验中心；绿茶 广西横县南方茶厂；白耙齿菌 自吉林省长白山采集的样品中分离得到，并经测序鉴定为白耙齿菌；血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽测定试验剂盒 南京建成生物工程研究所；辛伐他汀（批号：170909） 山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司；胆固醇（批号：C10178156）、猪胆盐（批号：C10203440） 上海麦克林生化科技有限公司。

3K15型台式冷冻高速离心机 德国赛默飞公司；Adventurer系列电子天平 美国奥豪斯公司；IKA RVB型旋转蒸发仪 德国IKA集团；BMJ-100型霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZHJH-C11068型超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；Olympus CKX41型倒置荧光显微镜日本Olympus公司；7100型全自动生化试剂仪 日本日立公司；Epoch型全波长酶标仪 美国Bio Tek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白耙齿菌发酵茶水提物的制备 将经驯化培养的白耙齿菌菌丝挑至茶叶中，在湿度为80%，温度为28 ℃的条件下培养，待菌丝在茶叶上长满后，将菌茶于60 ℃烘干即可得到白耙齿菌发酵茶（白耙齿菌发酵茶由本实验室独家驯化培养而成）。称取上述白耙齿菌发酵茶2 g，加入200 mL蒸馏水于100 ℃下提取5 min，过滤得滤液，残渣再加入200 mL蒸馏水100 ℃下提取5 min，过滤得滤液，共提取5次，合并滤液，将滤液浓缩至50 mL，即配成浓度为（含发酵茶水提物）40 mg/mL的白耙齿菌发酵茶汤，按照同样方法配制20、10 mg/mL的白耙齿菌发酵茶汤以及40 mg/mL的绿茶茶汤。

1.2.2 造模及给药方法 高血脂小鼠模型建立：雄性KM小鼠70只，体重（20±2）g，适应性喂养一周，饲养温度（25±1）℃，相对湿度 60%±5%，光照昼夜各12 h，随机分为7组，每组10只，其中一组作为空白组，实验全程喂养基础饲料，剩余60只小鼠给予高血脂饲料（基础饲料78.8%、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%猪胆盐）建模35 d后，禁食不禁水12 h，断尾尖取血，分离血清，测定各小鼠血脂水平，与空白组血脂水平比较，若P＜0.05或P＜0.01，则造模成功。将60只高血脂症小鼠按TC水平随机分成6组，每组10只，分别为模型组、绿茶组、辛伐他汀组、白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量组。

给药方法：白耙齿菌发酵茶高（400 mg/kg）、中（200 mg/kg）、低剂量（100 mg/kg），辛伐他汀（10 mg/kg），绿茶组（400 mg/kg），上述实验动物均按照10 mL/kg的体积灌胃，即灌胃白耙齿菌发酵茶高（40 mg/mL）、中（20 mg/mL）、低剂量（10 mg/mL），辛伐他汀（1 mg/mL），绿茶组（40 mg/mL）。每天相同时间灌胃给药一次，空白对照组和模型组灌胃等剂量的蒸馏水，连续给药35 d，每周称一次体重。

1.2.3 指标测定 灌胃给药35 d后，实验动物不禁水禁食12 h，摘眼球取血后，处死小鼠并进行解剖，离心分离血清（3000 r/min，4 ℃），采用酶标仪测定血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、ALP水平。剥离肝脏并称重，计算肝脏系数后，检测肝脏组织中SOD、MDA、GSH水平。取一部分肝脏组织置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋[27]并进行切片（4 μm）后进行苏木精-伊红（HE）染色，另取一部分肝脏使用 OTC（optimal cutting temperature compound）包埋，冰冻切片，使用油红O进行染色，并于显微镜下观察，各切片选取清晰、典型的视野，观察肝脏组织病理情况以及肝脏脂肪颗粒情况。肝脏系数计算公式为：肝脏系数=脏器重量/体重。

1.3 数据处理

采用SPSS21.0统计学软件进行数理统计，多组间使用单因素方差分析（ANOVA）进行比较，两两比较使用LSD法，组内、组间使用t检验进行统计，实验结果以平均值±SD表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝脏系数的影响

在实验过程中，空白对照组小鼠毛发顺滑，没有相互撕咬的现象；模型组小鼠毛发略微稀疏，精神状态略差，不爱走动；给药组以及辛伐他汀组与模型组对比，小鼠精神状态有所改善，且实验过程中各组无小鼠死亡。白耙齿菌发酵茶对小鼠体重的影响见表1，与空白对照相比，模型组小鼠体重明显增加，并具有极显著性差异（P＜0.01），说明建模成功；与模型组相比，辛伐他汀组、绿茶组以及白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量组小鼠体重均无显著性差异（P＞0.05）；绿茶组与模型组相比，肝重和肝脏系数均无显著性差异（P＞0.05）。高剂量的白耙齿菌发酵茶能极显著降低小鼠肝脏重量（P＜0.01）；辛伐他汀组以及白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量均能极显著降低小鼠的肝脏系数（P＜0.01）。综上，白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量虽然不能降低高血脂小鼠体重，但是能够极显著降低高血脂小鼠的肝脏系数（P＜0.01）。

表1 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝脏系数的影响Table 1 Effects of Irpex lacteus fermented tea on liver coefficient of hyperlipidemia mice

2.2 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠血脂水平的影响

白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠TC、TG、HDLC、LDL-C的影响结果如图1所示。与模型组相比，辛伐他汀及白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量均能显著降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平含量，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，绿茶组能够显著降低TG、LDL-C 水平（P＜0.05或P＜0.01），但降低程度不及白耙齿菌发酵茶各剂量组。上述结果显示白耙齿菌发酵茶具有降低高血脂小鼠血脂的作用。

图1 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠血脂四水平的影响Fig.1 Effects of Irpex lacteus fermented tea on four levels of blood lipid in hyperlipidemic mice

2.3 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠AST、ALT、ALP的影响

如图2所示，与模型组相比，辛伐他汀组及白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量组均能明显降低高血脂小鼠血清中AST、ALT、ALP水平，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；绿茶组 AST、ALT、ALP 水平与模型组相比均无显著性差异（P＞0.05）。上述结果表明，白耙齿菌发酵茶能降低高血脂小鼠的AST、ALT、ALP水平。

图2 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠AST、ALT、ALP的影响Fig.2 Effects of Irpex lacteus fermented tea on AST、ALT、ALP in hyperlipidemic mice

2.4 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠SOD、MDA、GSH的影响

白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠SOD、MDA、GSH的影响结果如图3～图4所示，与模型组相比，辛伐他汀组能够降低高血脂小鼠肝脏组织中MDA水平，升高 SOD、GSH水平，且具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；绿茶组SOD、MDA、GSH水平与模型组相比均无显著性差异（P＞0.05），白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量均能明显降低高血脂小鼠肝脏组织中MDA水平，升高SOD含量；白耙齿菌发酵茶高剂量可明显升高GSH含量，且具有显著性差异（P＜0.05），但中剂量和低剂量与模型组相比无显著性差异（P＞0.05），表明白耙齿菌发酵茶具有提高抗氧化酶活性，减少肝脏的脂质过氧化，减轻氧自由基对肝细胞的损害，从而达到保护肝细胞的作用。

图3 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠SOD的影响Fig.3 Effects of Irpex lacteus fermented tea on SOD in hyperlipidemic mice

图4 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠GSH、MDA的影响Fig.4 Effects of Irpex lacteus fermented tea on GSH、MDA in hyperlipidemic mice

2.5 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织病理学观察

白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织病理学观察结果如图5所示。空白对照组小鼠肝脏组织细胞形态正常，排列整齐，细胞边界清晰，细胞胞质未见溶解和空泡，未见细胞核萎缩或破裂等现象。模型组小鼠肝组织排列混乱，细胞间隙含有大量脂肪空泡，边界模糊，大量细胞核仁发生偏移和破裂，胞质有溶解现象，含有肝脏脂肪病变。辛伐他汀组小鼠肝脏组织排列较整齐，与模型组相比，边界较清晰，脂肪空泡量少，细胞核仁偏移较少，细胞破裂情况较少。绿茶组小鼠肝脏组织有大量脂肪空泡，大量核仁偏移，核膜出现破裂，细胞间隙增大，细胞病变明显。白耙齿菌发酵茶高、中、低剂量组小鼠肝脏组织脂肪空泡较模型组明显减少，核仁偏移明显改善，边界较模型组清晰，细胞核萎缩或破裂等现象明显减少，表明白耙齿菌发酵茶具有减轻肝脏病理损伤，保护肝脏细胞的作用。

图5 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织HE染色图Fig.5 HE staining of liver tissues of hyperlipidemic mice fed by Irpex lacteus fermented tea

2.6 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织油红O染色观察

白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织油红O染色观察结果如图6所示，空白对照组小鼠肝细胞形态较好，而模型组小鼠肝细胞出现大量脂肪滴。与模型组相比，辛伐他汀组小鼠肝组织的脂肪滴较少，细胞形态正常；绿茶组小鼠细胞含有大量脂肪滴，细胞形态改变，与模型组相比并无改善作用。白耙齿菌发酵茶高、中剂量不同程度的减少肝脏组织中的脂肪滴，从而改善肝脏中的脂质水平。但白耙齿菌发酵茶低剂量组减少脂肪滴的作用不明显。上述结果表明，高、中剂量白耙齿菌发酵茶具有改善脂肪肝的功效。

图6 白耙齿菌发酵茶对高血脂小鼠肝组织油红O染色图Fig.6 Oil red O staining of liver tissue of hyperlipidemic mice fed by Irpex lacteus fermented tea

3 结论

本研究将白耙齿菌与茶叶共发酵培养，制备成了白耙齿菌发酵茶，并通过高脂饮食诱导小鼠建立高血脂模型，对白耙齿菌发酵茶降血脂、保护肝、改善脂肪肝和抗氧化等进行研究。研究结果表明，白耙齿菌发酵茶能降低高血脂小鼠血清中TC、TG、LDLC、AST、ALT、ALP水平，升高 HDL-C水平；降低高血脂小鼠肝脏中MDA含量，提高SOD、GSH含量，改善肝组织病理学情况，减少肝脏脂肪颗粒，表明白耙齿菌茶具有降血脂、保护肝脏、减轻脂肪肝和抗氧化作用。白耙齿菌与茶叶共发酵后制成的白耙齿菌发酵茶，其次生代谢产物比茶叶和白耙齿菌的化学成分更加丰富，课题组预实验也证实了白耙齿菌发酵茶降血脂、保肝和抗氧化的作用优于白耙齿菌和茶叶，但白耙齿菌茶降血脂、保肝和抗氧化的药效物质基础将有待进一步研究。本研究将为功能茶的研究、茶产品的升级，乃至为改善高血脂症的药食同源物的开发提供新资源和新思路。