30 份红三叶种质资源耐铜性综合评价

2021-12-17 01:26张鹤山高秋张婷婷陆姣云田宏熊军波刘洋

草业学报 2021年12期

张鹤山，高秋，张婷婷，陆姣云，田宏，熊军波，刘洋 *

（1. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430064；2. 全国畜牧总站牧草种质资源保存中心，北京100125）

随着城镇工业化的发展，重金属污染带来的环境问题日益突出［1-2］。铜作为植物生长必需的微量营养元素，参与植物各种基本代谢活动［3］，然而，过量的铜会对植物产生毒害作用［4］。通常，当植物组织铜含量≥20 mg·kg-1干物质（dry matter，DM）会产生毒害作用，将导致植物形态、解剖、生理等方面的改变，从而降低植物的产量和质量［5-6］。近几十年，由于采矿、冶炼、废物处理、农药、杀菌剂和大气沉降等原因，铜被广泛释放到环境中［7-10］。许多地区的土壤受到了铜的轻度或中度污染［11］，如湖北已废弃3000 多年的铜绿山古冶炼渣矿的总铜含量达7789 mg·kg-1［12］，浙江哩铺铜矿区土壤中铜含量超过 700 mg·kg-1［13］。在一些果园，铜在土壤中积累得越来越多，山东省某苹果园的土壤铜浓度在2008-2014 年以每年1.37～1.45 mg·kg-1的速率递增［14-16］，巴西南部（里约热内卢）的一处葡萄园，土壤铜的最大浓度值高达3200 mg·kg-1。这些铜污染的土壤不仅造成农业粮食减产，而且会威胁人类的身体健康［17-18］。

国内外开展了许多环境中的铜修复研究［19］。目前，物理修复、化学修复和生物修复策略已被人们普遍采用，然而，高昂的成本和低下的效率限制了物理和化学修复措施的应用［20］，而植物修复技术因利用植物及其根际微生物对土壤污染物的吸收、提取、分解、转化和固定的特点，被学术界称为“绿色修复”，近年来备受关注。一些耐铜性或能够富集Cu2+的植物如海洲香薷（Elsholtzia harchowensis）［21］和蕨类植物［22］能够在高土壤铜含量环境中正常生长，已经在土壤铜污染修复中得到广泛应用。许多学者也开展了牧草类物种如巨菌草（Pennisetumsp.）［23］、苇状羊茅（Festuca arundinacea）［24］、苏丹草（Sorghum sudanense）［25］、杂交狼尾草（Pennisetum americanum×P.purpureum）［26］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［27-28］、紫云英（Astragalus sinicus）［29］等草种的耐铜性研究，并被用于土壤重金属污染的修复。

我国湖北、江西、湖南等地区有大量的铜尾矿，修复这些铜污染土壤成为生态保护建设的重要内容。红三叶（Trifolium pratense）是豆科车轴草属多年生草本植物，广泛栽培于长江流域及西南地区，是家畜重要的蛋白来源，也具有生长快、根系发达、地上部生物量高等潜在的植物修复能力。研究发现，红三叶可以在Cu2+含量为1200 mg·kg-1的土壤中正常生长，表现出较强的耐铜胁迫能力［30］，具有在铜矿区生产应用的潜力。鉴于此，本研究以来自国内外的不同红三叶种质为材料，在萌发期和苗期研究其生长发育特性并开展耐铜性综合评价，以期筛选出能够在铜尾矿或铜污染土壤正常生长的优良种质材料，为耐铜性红三叶新品种选育及开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

30 份红三叶种质材料由全国畜牧总站牧草种质资源保存中心提供。材料信息见表1。

表1 供试材料信息Table 1 Information of red clover germplasm resources

1.2 试验方法

萌发期胁迫试验在人工气候培养箱内进行，试验期12 d（2021 年1 月2 日-14 日），培养箱温度为（25±1）℃，光照设置 16 h 黑暗/8 h 光照交替进行。试验处理设置 4 个 Cu2+胁迫浓度：0.5、2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1，以去离子水处理为对照，每个处理4 次重复，每个重复100 粒种子。采用滤纸发芽法，每个发芽盒放置2 层滤纸，加入25 mL 相应浓度处理溶液，均匀摆放红三叶种子，于人工气候箱进行培养。试验过程中不再加入处理液。

苗期胁迫试验在人工气候室内进行，试验期 60 d（2021 年 1 月 5 日-3 月 6 日），气候室温度为（24±2）℃，湿度50%～60%。试验处理设置3 个Cu2+胁迫浓度：5、20 和50 mmol·L-1，对照为去离子水，每个处理4 次重复，每个重复8 株苗。采用盆栽法，花盆上部内径15 cm，底部内径13 cm，高15 cm，底部有孔；每个花盆装等量“品氏”泥炭土（PINDSTRUP SPHAGNUM），使土壤表面低于花盆约2 cm；每盆播种12～15 粒，出苗后定苗8 株，期间正常浇水；待幼苗正常生长至3 片真叶出现，停止浇水，7 d 后进行胁迫处理。方法是将所有试验花盆放入多个方形塑料试验箱内（60 cm×60 cm×15 cm），保证同一Cu2+胁迫浓度处理的种质材料放置在相同的试验箱内；将配制完成的某一浓度Cu2+处理液浇灌至对应的处理组花盆内，一次性浇透，然后向试验箱内加入相应浓度处理液至约5 cm 高，确保每个试验箱加入的Cu2+处理液量相等；对照组按相同方法加入等量去离子水。为防止溶液蒸发，用塑料膜将试验箱与花盆之间的空隙封闭，试验期间不再添加处理液或去离子水，利用泥炭土的吸水特性可以保证土壤中的Cu2+浓度维持不变。

1.3 测定指标及方法

在种子萌发第10 天统计发芽数及测定胚根特征指标。发芽率（germination ratio，GR）：统计每个发芽盒内的发芽种子数，以发芽种子数占总种子数的百分比表示发芽率；胚根长度（radicle length，RL）和胚根直径（radicle diameter，RD）：利用扫描仪（Expression 10000XL，日本）扫描根系后，用根系分析系统（WinRHIZO software 5.0，Regent instruments，加拿大）进行分析，每个重复测定10 株，取平均值。

苗期胁迫各性状指标在胁迫14 d 后进行。存活率（survival ratio，SR）：统计每个花盆红三叶存活株数，以植株未枯死并有正常绿色生长芽为存活株，以胁迫后存活株数占处理前定苗株数的百分比表示存活率；地上生物量（aboveground biomass，AB）：收获每株幼苗地上部分茎叶（已死亡植株收集其干枯茎叶），置于烘箱105 ℃杀青1 h，然后75 ℃烘干至恒重后称重；地下生物量（underground biomass，UB）：收获每株幼苗地下部分根系，洗净后擦干水，置于烘箱105 ℃杀青1 h，然后75 ℃烘至恒重后称重；根冠比（root to stem ratio，RSR）以地下生物量与地上生物量的比值表示；利用根系分析系统测定根总长度（total root length，TRL）、根尖数（number of root tip，NRT）和根体积（root volume，RV），每个重复测定6 株。

1.4 耐铜性综合评价

采用隶属函数法［31-32］进行红三叶耐铜性综合评价；参照张鹤山等［33］的方法计算各指标权重系数。

1.4.1 标准值确立假定一个耐铜性理想品种的参考数列，记为｛X0(k)｝（k=1，2，3，…，n），n为用于评价的性状指标数。被评价种质的比较数列记为｛Xi（k）｝（i=1，2，3，…，m），m为红三叶种质数。关联系数计算公式为：

1.4.2 各指标权重系数

式中：ωk表示第k个指标的权重系数；Pk为第k个指标的变异系数。

1.4.3 各种质关联系数

式中：ri为第i个种质材料的关联系数，其值越大表示该种质越接近理想品种，其耐铜性越强。

1.5 数据统计分析

以相对值为基础分析数据，即胁迫处理下的测定值与对照处理下的测定值的比值。采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，采用Duncan 法多重比较，采用分层聚类法聚类分析。

2 结果与分析

2.1 萌发期Cu2+胁迫下各性状特征及差异分析

Cu2+胁迫对红三叶种质发芽率、胚根长度和胚根直径具有显著影响（表2）。随着Cu2+浓度的增加，发芽率逐渐下降，Cu2+胁迫浓度在0.5～4.0 mmol·L-1时，红三叶发芽率为对照的94%，但浓度增至8.0 mmol·L-1时，发芽率下降至对照的78%。胚根长度和胚根直径受Cu2+胁迫影响较为明显，在8.0 mmol·L-1的Cu2+胁迫下，红三叶胚根无法正常生长。在0.5 mmol·L-1时，胚根长度为对照的54%，在4.0 mmol·L-1时仅为对照的13%；胚根直径在Cu2+胁迫下增大，即使Cu2+浓度在0.5 mmol·L-1时胚根直径也为对照的110%，在Cu2+浓度为2.0 mmol·L-1时更是达到156%。

表2 红三叶萌发期发芽率及根系特征Table 2 Germination rate and root characteristics of red clover in the germination stage

不同种质间性状差异最大的为4.0 mmol·L-1处理下的胚根长度，其最大值（0.47）为最小值（0.06）的7.83倍，差异最小的为2.0 mmol·L-1处理下的发芽率（1.28 倍）。相同性状在不同处理下其指标值亦有差异，发芽率在8.0 mmol·L-1浓度胁迫下比其他3 个处理有更大的变异幅度，其最大值为最小值的1.52 倍，而在0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1处理下分别为 1.30、1.28 和1.35 倍；胚根长度变化幅度随浓度的增加而增大，在 0.5、2.0 和4.0 mmol·L-1处理下其最大值分别为最小值的1.73、3.30 和7.83 倍；而胚根直径在2.0 mmol·L-1处理时其指标最大值为最小值的1.86 倍。变异系数结果表明，4.0 mmol·L-1处理下的胚根长度变异程度最大（70.14%），其次为2.0 mmol·L-1处理下胚根长度（30.78%），而2.0 mmol·L-1处理下发芽率变异程度最小（5.45%），这与各性状特征差异统计结果一致。经方差分析，红三叶种质在发芽率和胚根长度的所有处理梯度均具有显著差异性（P＜0.05），其中发芽率在 0.5、2.0 和 4.0 mmol·L-1处理下、胚根长度在 2.0 和 4.0 mmol·L-1处理下种质间在 0.001水平差异显著（P＜0.001）；胚根直径仅在0.5 mmol·L-1的Cu2+胁迫下种质间存在显著差异（P＜0.05）。

2.2 苗期Cu2+胁迫下各性状特征及差异分析

相比于萌发期，红三叶幼苗具有更高的Cu2+耐受性（表3）。在5 mmol·L-1胁迫时，红三叶所有种质均可存活并正常生长，在20 mmol·L-1时平均存活率达到87%；但是Cu2+胁迫浓度达到50 mmol·L-1时，种质平均存活率快速下降，仅为3%。Cu2+胁迫显著抑制了红三叶茎叶和根系的生长，Cu2+胁迫处理下的红三叶地上生物量和地下生物量均低于对照，在胁迫浓度为5 mmol·L-1时分别为对照的69%和57%，在50 mmol·L-1时则仅为对照的31%和10%。从根冠比看，所有处理的根冠比相对值均小于1，说明Cu2+胁迫对根系生长的抑制强于地上茎叶部分。表征根系特征的指标如根总长度、根尖数和根体积在不同Cu2+胁迫浓度下具有一致的变化趋势，均随胁迫浓度的增加而减小，在5 mmol·L-1时，根总长度、根尖数和根体积分别为对照的76%、60%和68%，在50 mmol·L-1时分别降低到对照的19%、11%和28%，这与地下生物量性状变化趋势相一致。变异分析表明，红三叶苗期变异系数最大的性状是50 mmol·L-1Cu2+胁迫下的存活率，为175.71%，其次为50 mmol·L-1Cu2+胁迫下根冠比，变异系数为109.40%。在不同Cu2+浓度处理下，各性状变异系数均随胁迫浓度的增加而增大，说明Cu2+胁迫浓度的增加进一步突显了种质间的差异。进一步方差分析表明，不同处理浓度下，各性状在红三叶种质间的差异性有所不同。在5 mmol·L-1处理下，不同红三叶种质材料间只有根尖数存在显著差异（P＜0.01）；而在20 mmol·L-1处理时，所有性状均存在显著差异（P＜0.05）。在50 mmol·L-1处理下，除存活率性状外，种质间其他性状均差异显著。可见，相比于低Cu2+胁迫浓度（5 mmol·L-1），20 或50 mmol·L-1的Cu2+胁迫浓度可以更好地区分红三叶不同种质间耐铜性的差异。

表3 苗期各指标特征差异性Table 3 The difference between characteristics of red clover in the seedling stage

2.3 苗期各性状差异性分析

为进一步理解Cu2+胁迫浓度和种质双重因素对红三叶各性状的影响，对10 个性状进行了双因素方差分析（表4）。分析表明，所有性状在不同Cu2+胁迫浓度间和不同种质间均达到差异显著水平（P＜0.05），其中，除根冠比和存活率外，其余性状更是在P＜0.001 水平上呈显著差异，说明这些性状可以作为红三叶种质耐铜性筛选评价的有效指标。综上分析，0.5 mmol·L-1Cu2+处理下的3 个萌发性状（发芽率、胚根长度和胚根直径）和20 mmol·L-1Cu2+处理下的7 个苗期性状（存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根总长度、根尖数、根体积）在不同红三叶种质间均具有显著的差异性，因此，本研究将这些指标用于后续的灰色关联分析、相关性分析和回归分析。

表4 10 个耐铜性指标方差分析Table 4 Analysis of variance of 10 copper resistance indexes

2.4 不同性状相关性分析

对所有材料的不同耐铜性指标进行相关性分析（表5），胚根长度与胚根直径具有显著的负相关关系（P＜0.01），胚根长度越小、直径越大；地下生物量与地上生物量、根冠比、根尖数间具有显著相关关系，且与根冠比、根尖数在0.001 水平显著相关；此外，根尖数与胚根长度、根总长度亦呈现显著的相关性，其中与根总长度在0.001 水平上显著相关。其余性状间未表现出显著相关性。

表5 10 个耐铜性状相关性分析Table 5 Analysis of correlation of 10 copper resistance indexes

2.5 红三叶耐铜性综合评价

利用上述选取的10 个性状指标进行隶属函数分析，首先利用公式（1）确定各材料每个性状的标准值，然后利用公式（2）确定发芽率、胚根长度、胚根直径、存活率、地上生物量、地下生物量、根冠比、根总长度、根尖数和根体积的权重系数，分别为0.029、0.060、0.064、0.040、0.109、0.152、0.158、0.107、0.154 和 0.127，再通过公式（3）计算红三叶不同种质与理想品种关联系数（综合评价值）（表6）。种质CF022167 与理想材料的关联度最高，综合评价值为0.698，表示其对Cu2+胁迫的耐受性最强；其次为种质CF022178 和CF022232，综合评价值分别为0.643 和0.636；关联度最低的是种质CF022234，综合评价值仅为0.390。

表6 红三叶耐铜性综合评价值及预测值Table 6 Comprehensive evaluation and prediction value based on 4 important traits of copper tolerance in red clover

为筛选红三叶耐铜性评价的关键指标，依据最小二乘法，通过回归分析选择对红三叶耐铜性评价具有显著性的因子，得到最优回归模型。以上述耐铜性综合评价关联系数为因变量，以各指标相对值为自变量，采用多元逐步回归分析建立最优回归方程，得出各种质耐铜性预测值（D值）与指标的关系：D=0.1573X1+0.147X2+0.158X3+0.108X4，R2=0.977（P＜0.01），式中：X1为胚根长度；X2为幼苗存活率；X3为地下生物量；X4为根总长度。分析发现，利用该回归模型预测的红三叶耐铜性强弱与综合评价结果基本一致（表6），其预测值排序位次和综合评价值相同的有16 个种质，占种质材料总数量的1/2 以上，12 个种质仅向前或后波动一个位次，位次波动最大的是种质CF022230 和CF022172，其预测值比综合评价值上升两个位次。可见，以4 个关键指标建立的预测模型可以有效地对红三叶种质耐铜性强弱进行初步评价。

3 讨论

重金属对植物种子萌发和生长发育的影响一直是研究者关注的焦点［34］。许多研究表明，过量的Cu2+能够氧化损伤植物细胞结构［35-36］，降低种子萌发率，抑制植物根系生长［37-38］，这已在牧草植物如红三叶［39］、紫花苜蓿［40］、多花黑麦草（Lolium multiflorum）［41］、苏丹草［25］以及作物类如水稻（Oryza sativa）［42］、小麦（Triticum aestivum）［43］、番茄（Solanum lycopersicum）［44］等物种内得到证实。鱼小军等［39］对铜胁迫下的红三叶发芽率的研究表明Cu2+浓度为 200 mg·L-1（3.12 mmol·L-1）时相对发芽率为 82%，赵思怡等［45］发现 Cu2+浓度为 100 mg·L-1时 51 份红三叶种质的平均相对发芽率为62%，本研究中30 份红三叶平均相对发芽率在4.0 mmol·L-1时仍达到94%，可能是由种质数量及种质材料的差异引起的。胚根长度随着Cu2+胁迫浓度的增加而降低，在8.0 mmol·L-1时胚根生长停滞，可能是由于植物中的铜离子毒性导致细胞伸长受到抑制［46-47］。相对于发芽率，红三叶胚根对Cu2+胁迫更为敏感，王波等［48］在南荻（Triarrhena lutarioriparia）种子萌发中也发现了类似的现象，这可能是由于种子萌发时根尖最先突破种皮吸水，从而使根尖受胁迫时间较长，积累更多的重金属［49］。因此，众多研究者通常将根系变化作为非生物胁迫评价的主要依据。

重金属主要积累在草本植物的根部，以降低其对植物地上部分的损伤程度［50-52］。韩晓姝等［30］发现红三叶根部对铜的积累高于茎叶部分，根系受危害程度更明显，铜胁迫更多的是降低红三叶的地下生物量，而对株高和地上生物量并没有显著影响。本研究结果与其不尽相同，本研究中所有铜胁迫处理不仅显著降低了红三叶的地下生物量、根总长度、根体积和根尖数，也抑制了红三叶地上部分的生长，而且在高浓度（50 mmol·L-1）铜胁迫下，植株几乎全部死亡。造成两者结果不同的原因可能是前者是在红三叶植株成株后（生长季结束后）测定的数据，由于植物本身对胁迫有防御和修复能力［53-54］，使得不同胁迫强度间的差异弱化；而本研究指标测定是在幼苗期（胁迫后第14 天），其对外界胁迫的反应较为敏感，更能反映红三叶种质间的性状差异。

种子萌发期对外界胁迫较为敏感，而苗期能更好地模拟植物自然生长条件，因此许多学者分别在种子萌发期［6，39，44，55］和幼苗生长阶段［30，56-57］研究铜胁迫对植物的影响。然而，植物抗逆性评价是一个综合的多指标分析过程，更全面的指标可以使评价结果更客观［32，58-59］。本研究采用隶属函数法，以红三叶萌发期和苗期的生长性状指标进行耐铜性综合评价，所有参与评价的性状在红三叶不同种质间均具有显著差异性，能够有效区分种质材料间耐铜性的强弱。对各指标的权重系数分析表明，苗期指标具有更大的权重，其中地下生物量权重最大，幼苗期的根部特征指标权重占比约70%，说明幼苗根系特征是红三叶耐铜性评价的主要指示性状。综合评价分析表明，种质CF022167、CF022178 和CF022232 具有较强的耐铜能力，这与赵思怡等［45］研究结果有所差异，虽然其也发现种质CF022167 具有较强的耐铜性，但却将种质CF022232 耐铜性评价为弱，一方面可能是本研究评价指标除了萌发期的3 个指标之外，还选择了幼苗期的7 个指标，而后者只采用萌发期的性状；另一方面，两者选的试验样本种类和数量不尽相同，抗性评价本就是一个相对的综合比较，因此试验材料的差异也会造成结果的不同。

红三叶各性状间具有不同程度的相关性［60］，选择更多的指标参与评价使得结果更准确，但也会增加研究难度，造成资源浪费。因此，筛选在抗逆性评价中起关键作用的指示性指标成为一种有效手段［61］。本研究从10 个评价指标中筛选出胚根长度、幼苗存活率、地下生物量和根总长度4 个关键性指标，建立其耐铜性预测值与综合评价值回归方程，依次对红三叶种质耐铜性进行初步筛选。王瑞等［61］利用筛选出的5 个耐盐关键指标对42 份偃麦草（Elytrigia repens）进行了评价，其预测值与综合评价值相关系数为0.979，本研究中相关系数为0.977，达显著相关水平（P＜0.01）。由此可见，以这4 个关键指标构建的回归模型可以有效地对红三叶耐铜性进行初步评价。

4 结论

无论在萌发期还是幼苗生长阶段，Cu2+胁迫对红三叶生长发育均有显著的抑制作用，胚根长度随Cu2+浓度的增加而减小，但胚根直径变大；相对于发芽率，胚根生长对Cu2+胁迫更为敏感。在铜胁迫下，红三叶幼苗地上生物量和地下生物量显著降低，根尖数和根总长度减少。红三叶萌发期和苗期各性状在不同Cu2+浓度间具有显著差异性，并且同一性状在不同红三叶种质间也具有显著差异性。

根系相关性状如生物量、根尖数、根总长度是红三叶耐铜性评价的重要权重指标，胚根长度、幼苗存活率、地下生物量和根总长度4 个指标可以作为红三叶耐铜强弱预测的关键指标。红三叶种质CF022167、CF022178 及CF022232 具有较高的铜耐受性，可以作为红三叶育种基础材料或在生产中直接利用。