四川老鹰茶醇提物的抑菌及抗氧化活性研究

李宇航，兰 林，谢 玲，钱叶迁，李玉锋

西华大学，四川 成都 610039

老鹰茶，又称白茶、老荫茶、老人茶等，由毛豹皮樟（Litsea coreanaLevl Var.lanuginose(Migo)Yang et P. H. Huang）的嫩芽叶或枝叶加工制成，是我国西南地区长期饮用的一种植物代茶[1-2]。有关老鹰茶的历史记载最早于乾隆十一年（1746年）的《犍为县志》，此后的《丹棱县志》《城口厅志》《合川县志》《苍溪县志》等方志中均有记载[3-4]。2012年，原国家质检总局批准对石棉县6个乡镇的老鹰茶实施地理标志产品保护[5]。老鹰茶茶汤呈琥珀色，香气芳香和樟香，滋味醇和、回甘，具有消渴祛暑、止咳化痰及健胃开脾等功效，且无毒副作用[6-7]。

研究表明，老鹰茶的主要生物活性物质是多酚类与黄酮类物质，具有抗氧化、抑菌、降血糖和抗癌等作用[8-9]。目前，关于四川不同地区老鹰茶醇提物的总多酚和总黄酮含量及其抑菌和抗氧化活性强弱的对比未见研究报道。本试验研究以四川3个不同产地的老鹰茶及老鹰茶植物的鲜叶为原料，采用超声波辅助提取技术分离提取富含多酚与黄酮的醇提物，分别测定多酚和黄酮含量及其抑菌和抗氧化能力，旨在为老鹰茶资源的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种及培养基

供试菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）、枯草芽孢杆菌（Baci llus subtilis，CMCC（B）63501）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae，CMCC（B）51105）和大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922），均购自中国科学院微生物研宄所菌种保藏中心；所用培养基为营养琼脂液体培养基和固体培养基。

1.1.2 主要试验材料

老鹰茶，分别购买自四川省雅安市石棉县、广元市青川县和宜宾市叙州区农茶商；老鹰茶鲜叶，2020年4月分别采摘自雅安市石棉县、广元市青川县和宜宾市叙州区的农商茶园。

1.2 试验方法

1.2.1 样品醇提物的制备

将3种茶叶和3种鲜叶分别于40℃烘干，粉碎，过40目筛；称取50 g干粉，以70%乙醇水溶液为提取溶剂，超声功率300 w、料液比1 g∶50 mL、温度60℃下浸提60 min，过滤；重复提取两次，合并提取液。于60℃减压浓缩得浸膏，置于真空冷冻干燥机干燥，得6种样品醇提物干粉[10]。

1.2.2 样品醇提物提取率计算[11]

1.2.3 多酚含量测定

依照GB/T 8313—2018的福林酚比色法[12]测定。

1.2.4 黄酮含量测定

依照王宗成等[13]的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定其中黄酮总量。

1.2.5 抑菌活性测定

取适量乙醇提取物加乙醇溶解，配成浓度分别为100 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL的样品溶液。采用牛津杯法[14]测定6种样品醇提物的抑菌圈直径。4种细菌接种活化后用无菌生理盐水把菌悬液浓度稀释到1.0×108CFU/mL。将营养琼脂加至培养皿中，吸取0.2 mL菌悬液加入培养基涂布均匀，将涂布好的培养皿分为4个区域（提取液浓度分别为100 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL，等体积乙醇为对照），每个培养皿等距离放置 4个牛津杯，注入各个浓度的样品液200 uL，于37℃恒温培养箱培养24 h后测量抑菌圈直径[15]。

1.2.6 DPPH自由基清除率测定

参照Hatano[16]测定DPPH自由基清除能力方法并稍作修改。称取一定量的DPPH用无水乙醇配制成2×10-4mol/L DPPH溶液。准确量取2 mL不同样品提取液和2 mL DPPH溶液混合均匀，黑暗中反应30 min，3500 r/min离心10 min，取上清液于517 nm处测定吸光值。以BHT作为阳性对照，其计算公式如下：

式中，A0为无水乙醇和DPPH溶液的吸光值；A1为提取液和DPPH溶液的吸光值；A2为提取液和无水乙醇溶液的吸光值。

1.2.7 总还原能力测定

参照Vaquero[17]测定总还原力方法并稍作修改。在10 mL离心管中分别加入0.2 mol/L pH值6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和不同样品提取液1 mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20 min。取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应，3500 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2 mL蒸馏水和0.5 mL 1%三氯化铁，混匀后静置10 min，在700 nm处检测吸光值。以蒸馏水为空白对照，BHT作为阳性对照。

1.3 数据分析

所有实验均重复3次，取平均值，以X±SD表示；采用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计学分析，通过单因素方差分析的Duncan’s法进行差异性显著分析，显著性水平设定为0.05。绘图采用Origin 9.1软件。

2 结果与分析

2.1 样品醇提物提取率

表1结果表明，除石棉老鹰茶和叙州老鹰茶差异不显著外，其余样品之间差异显著（P< 0.05）。其中青川老鹰茶的提取率最低，为（19.72±0.47）%；石棉老鹰茶鲜叶的提取率最高，为（26.73±0.68）%。老鹰茶鲜叶的提取率普遍高于老鹰茶。

表1 样品醇提物提取率Table 1 Extraction rate of ethanol extract of the samples

2.2 多酚及黄酮总量

根据没食子酸的浓度拟合回归方程为Y=0.0123x + 0.0025、R2= 0.9992和芦丁的拟合回归方程为Y= 0.0131x + 0.0265、R2= 0.9993，可见具有良好的线性关系。由图1可知：6种样品的多酚含量差异显著，其中石棉老鹰茶鲜叶多酚含量最高，为（22.1±0.11）%；含量最低的是青川老鹰茶，为（16.24±0.17）%。黄酮含量测定结果中，除石棉老鹰茶分别与叙州老鹰茶和青川老鹰茶鲜叶差异不显著外，其他样品之间均差异显著；其中石棉老鹰茶鲜叶黄酮含量最高，为（16.77±0.14）%；含量最低的是青川老鹰茶，为（13.84±0.55）%。老鹰茶多酚和黄酮含量明显低于鲜叶，原因可能是在加工过程中造成了一定的损失[18]。

图1 样品醇提物总多酚和总黄酮含量Figure 1 Contents of total polyphenols and total flavonoids in the ethanol extract of the samples

2.3 抑菌效果

采用牛津杯法测量抑菌圈大小，结果显示：在不同浓度（100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL）下，6种样品醇提物均对实验中的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌和大肠杆菌具抑菌活性，说明老鹰茶和老鹰茶鲜叶有着广谱的抑菌作用（表2）。

表2 不同浓度样品醇提物对细菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of ethanol extracts of the samples with different concentrations on bacteria

在所有样品醇提物中，石棉老鹰茶鲜叶对4种细菌的抑制作用最强，抑菌圈直径在1.69 ～2.56 cm；其次为叙州老鹰茶鲜叶，抑菌圈直径在1.58 ～ 2.48 cm；对细菌抑制作用最弱的为青川老鹰茶，抑菌圈直径在0.95 ～ 2.14 cm。6种样品醇提物对痢疾志贺氏菌的抑制效果最好，其次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，且随着提取液质量浓度的增加抑制效果增强。其他实验表明，老鹰茶总黄酮提取物除对大肠杆菌和产气杆菌无明显作用外，对供试的金黄色葡萄球菌与枯草杆菌等均表现出一定的抑菌效果[19]。综上，6种样品醇提物对4种细菌的抑制作用从强到弱排列为石棉老鹰茶鲜叶 > 叙州老鹰茶鲜叶 > 青川老鹰茶鲜叶 > 石棉老鹰茶 > 叙州老鹰茶 > 青川老鹰茶。

2.4 对DPPH自由基的清除作用

由表3可知：除叙州和青川老鹰茶DPPH自由基清除能力的IC50值差异不显著外，其余差异显著（P< 0.05）。6种样品醇提物的DPPH清除能力均高于阳性对照BHT，均可作为天然抗氧化剂的优质来源。其中，DPPH自由基清除能力的IC50值最高的为青川老鹰茶，为（9.95±0.39）µg/mL；最低的为石棉老鹰茶鲜叶，为（8.16 ±0.08）µg/mL。三种老鹰茶的DPPH自由基清除能力的IC50值均高于三种老鹰茶鲜叶，由此可见老鹰茶鲜叶的抗氧化能力更强。比较DPPH自由基清除率能力，由强至弱的顺序为石棉老鹰茶鲜叶 > 叙州老鹰茶鲜叶 > 青川老鹰茶鲜叶 > 石棉老鹰茶 > 叙州老鹰茶 > 青川老鹰茶 > BHT。

表3 样品醇提物对DPPH自由基的清除作用Table 3 Scavenging effect of ethanol extract of the samples on DPPH radical

2.5 总还原能力

由图2可知：6种样品醇提物和对照品BHT的总还原能力通过吸光度值进行比较，还原能力均随着浓度的增加而增加。石棉老鹰茶鲜叶在6个浓度中均比另外5种样品醇提物的吸光度值高，并且6种样品醇提物的吸光度值均高于阳性对照BHT；石棉老鹰茶鲜叶的总还原能力最强，其次是叙州老鹰茶鲜叶的总还原能力较强。3个地区的老鹰茶比较，石棉老鹰茶总还原能力最强，青川老鹰茶总还原能力最弱。总还原能力由强到弱的顺序为石棉老鹰茶鲜叶>叙州老鹰茶鲜叶>青川老鹰茶鲜叶>石棉老鹰茶>叙州老鹰茶>青川老鹰茶>BHT。出现这种结果的原因可能是生物活性物质含量的差异影响着它们的还原能力，进而影响抗氧化能力，因为茶多酚是茶叶中重要的抗氧化物质[20]。

图2 样品醇提物的总还原能力Figure 2 Total reduction capacity of ethanol extract of the samples

3 讨论

通过对石棉老鹰茶、青川老鹰茶、叙州老鹰茶及石棉老鹰茶鲜叶、青川老鹰茶鲜叶、叙州老鹰茶鲜叶醇提物的提取得率与醇提物中多酚及黄酮总含量的测定，以及醇提物抑菌活性和抗氧化活性研究比较发现，6种醇提物中，石棉老鹰茶鲜叶的提取率（26.73±0.68）%最高，多酚含量最高，为（22.10±0.11）%，黄酮含量（16.77±0.14）%也最高；石棉老鹰茶鲜叶对DPPH自由基清除作用及总还原能力最强。6种样品醇提物分别对4种细菌有一定抑制作用，其中石棉老鹰茶鲜叶对痢疾志贺氏菌的抑制效果最好，其抑菌圈直径为2.56 cm。试验研究结果表明，四川6种老鹰茶的醇提物具有不同的抑菌活性和抗氧化活性，其活性与多酚及黄酮含量存在一定相关；石棉老鹰茶鲜叶多酚和黄酮含量较高，抑菌活性和抗氧化活性较好。可见，老鹰茶在代茶植物开发中具有较广阔的应用前景。