橙子番茄混合果酒带渣主发酵工艺优化

李丹，邓仕彬，刘涛，郑常玲，汪秀妹，黄雅茹，陈雅芳

（莆田学院环境与生物工程学院，枇杷种质资源创新与利用福建省高校重点实验室，福建 莆田 351100）

橙子是我国常见的一种柑橘类水果，其表皮颜色鲜艳，果肉和果汁占比高，味道清甜，营养丰富。橙子属于不容易腐烂发霉的水果，保存期相对较长。橙子有较高的营养价值，维生素含量较高[1]。此外还具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗过敏、延缓衰老、滋润养颜、补肝安神等重要生理功能，有益于人体健康[2-4]。番茄是一种常见的营养丰富的果蔬，外观呈红色，既可以生食、炊后食用，也可加工制成酱、汁或制成番茄罐头保藏，是老幼皆宜的果蔬[5]。番茄中的番茄红素含量较高[6]，番茄红素具有抗氧化功能和清除自由基能力，还能发挥抗衰、抑癌等生理功能[7-8]。由于番茄不宜长时间贮存且不能长途运输，采摘后应尽快利用，避免造成严重损失[9]。随着消费多元化和营养健康果酒方面消费需求的增长，市面上单一品种的葡萄酒已经不能满足消费者的需要[10]，因此以橙子和番茄作为主要原料，研制具有抗氧化能力且高营养价值的酿制复合果酒，可以满足消费者对健康多元化食品的需要。

挥发性成分的种类、含量影响着果酒的感官品质[11]。傅里叶红外光谱技术（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）具有无损快速鉴定复杂体系官能团的特点。橙子和番茄中的抗氧化活性成分随着发酵过程的进行，逐渐渗透到酒液中，使果酒具有清除自由基的作用[12]。本试验以橙子、番茄为主要试材，通过改变果浆体积比、焦亚硫酸钠添加量、初始糖度、酵母接种量4个条件，以优化混合果酒的发酵工艺，在分析各因素对混合果酒的感官品质影响的基础上，采用响应面（Box-Behnken）试验优化条件。采用气相色谱-质谱联用技术对优化后的混合果酒的香气成分进行分析，并对混合果酒的抗氧化性能进行分析，采用傅里叶红外光谱技术测定果酒的特征官能团信息，丰富果酒的市场。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

伦晚橙、番茄：市售；蔗糖：厦门古龙食品有限公司；葡萄酒、果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；纤维素酶（100 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；焦亚硫酸钠（食品级）：河南华兴生物科技有限公司；无水柠檬酸（食品级）：福建缘菱鑫生物科技有限公司；硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AR12CN型电子天平、STARTER 2100酸度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；DK-S24恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；PYX-300G-B恒温培养箱：广东科力韶关实验仪器有限公司；PAL-1糖度计：广州爱拓（ATAGO）科学仪器有限公司；RHW-80酒精浓度计：漳州市新奥光电仪器有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；V-1100D可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；MJWBL5431J搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；H1850医用离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；QP2010气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；TENSORⅡ傅里叶红外光谱仪：德国布鲁克科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 混合果酒发酵操作要点

将橙子和番茄清洗干净，切块后在打浆机中打浆，橙子果浆[橙子∶水=1∶1（体积比）]与番茄果浆[番茄∶水=2∶1（体积比）]按照一定体积比混合，混合果浆加入一定量的焦亚硫酸钠，80 mg/L果胶酶和80 mg/L的纤维素酶，搅拌溶解，放入50℃水浴锅中酶解2 h，随后以白砂糖调节混合果浆的初始糖度，以柠檬酸调节pH值至3.5。将一定量的酵母加入到30 mL糖液（糖度为5°Brix）中，在38℃下活化0.5 h。将酵母液加入至果浆完成酵母接种，密封置于25℃恒温培养箱进行发酵。形成的混合果酒经过澄清、过滤后，将成品进行糖度、酒精度测定和感官评定。

1.3.2 单因素试验

按照 1.3.1 的方法，研究果浆体积比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、初始糖度（16、18、20、22、24、26 °Brix）、焦亚硫酸钠添加量（10、30、50、70、90 mg/L）、酵母接种量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L） 和发酵时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9 d）对混合果酒品质的影响。

1.3.3 响应面试验

分析单因素试验对混合果酒品质的影响，选择初始糖度、焦亚硫酸钠添加量、酵母接种量进行响应面优化，得到混合果酒的最佳工艺。试验因素水平见表1。

表1 响应面因素水平设计Table 1 Factors and levels of Box-Behnken testes design

1.3.4 混合果酒体外抗氧化活性测定

·OH清除率和Fe3+还原力的测定参考程宏桢等[12]的方法。

1.3.5 理化指标及感官评价方法

色度和透光率参考梁冬梅等[13]的方法；酒精度采用酒精度计测定；pH值采用酸度计测定；糖度采用糖度计测定；还原糖、干浸出物参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》进行测定；感官评价参照GB/T 15037—2006《葡萄酒》检测。邀请接受过感官培训的评定小组（10人），对混合果酒的色泽、透明度、香气、滋味及典型性进行综合评价，最终得分取平均值，评分标准见表2。

表2 感官评分标准Table 2 Sensory rating criteria

1.3.6 香气成分测定

采用气相色谱-质谱联用，参考马德秀等[14]、高馨雨等[15]和贾恺等[16]的方法进行测定。

1.3.7 特征官能团测定

将酒液干燥后进行FTIR测定。

1.4 数据处理

采用Excel 2019整合数据，Origin 8.5绘图，Design Expert8.0.6进行响应面优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 果浆体积比对混合果酒感官评分的影响

将橙子和番茄的果浆分别按照 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的体积比进行混合，添加果酒专用酵母进行发酵，发酵8 d后对混合果酒进行感官评价，感官评分见图1。

图1 不同果浆体积比制得的混合果酒的感官评分Fig.1 Sensory evaluation of mixed fruit wine prepared with different pulp volume ratio

由图1可知，橙子和番茄果浆体积比为1∶2时，发酵制得的混合果酒感官评分最高。在此条件下，混合果酒颜色呈淡橙色或淡红色，有光泽且澄清，口感较柔和。番茄的香甜味较大程度地掩盖了橙子的苦味。因此，后续优化试验选用果浆体积比1∶2酿造混合果酒。

2.1.2 发酵时间对混合果酒发酵的影响

不同初始糖度下混合果酒糖度随着时间的变化结果见图2。

图2 不同初始糖度下糖度随发酵时间的变化Fig.2 Change in sugar contents with fermentation time under different initial sugar content

由图2可知，随着混合果酒发酵时间的延长，混合果酒的糖度逐渐降低，发酵6 d后，糖度呈稳定趋势。因此，后续优化试验选择发酵时间为6 d。

2.1.3 初始糖度对混合果酒发酵的影响

初始糖度对混合果酒发酵的影响见图3。

由图3可知，初始糖度在16°Brix～24°Brix范围内，酒精度随初始糖度增加而上升。这是由于在此初始糖度范围内，可利用营养物质多，酵母生长繁殖旺盛，生成酒精量就越多。初始糖度在24°Brix～26°Brix范围内，酒精度变化很小。这是由于酒液中糖含量较高，发酵酒液渗透压升高，酵母不能生长到理想的状态，影响了酒精的合成。由于果酒酒精度不必要求过高，而过高的糖度会影响混合果酒口感并且浪费材料，结合感官评分的结果，确定初始糖度为24°Brix为较优条件。

图3 初始糖度对混合果酒发酵的影响Fig.3 Effect of initial sugar content on fermentation of fruit wine

2.1.4 焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响

焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响见图4。

图4 焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响Fig.4 Effect of addition amount of sodium pyrosulfite on fermentation of fruit wine

由图4可知，在试验范围内，焦亚硫酸钠添加量为70 mg/L时，酒精度最大。混合果酒中添加焦亚硫酸钠可降低微生物的生存率，焦亚硫酸钠添加量在10mg/L～70 mg/L时，酒液中其他杂菌难以存活而酵母菌可以生存，酒液中的白砂糖被酵母菌中的蔗糖酶水解为单糖，生成酒精和CO2，因此酒精度升高，糖度降低。当焦亚硫酸钠添加量为90 mg/L时，焦亚硫酸钠浓度过高抑制酵母菌的生长繁殖，酵母菌无法利用白砂糖转化为酒精，因此酒精度低，糖度升高。结合感官评分，确定焦亚硫酸钠添加量70 mg/L为较优条件。

2.1.5 酵母接种量对混合果酒发酵的影响

酵母接种量对混合果酒发酵的影响见图5。

图5 酵母接种量对混合果酒发酵的影响Fig.5 Effect of inoculation amount of yeast on fermentation of fruit wine

由图5可知，当酒液中酵母接种量为0.4 g/L时，酒精度最大，糖度最小。酵母接种量低于0.4 g/L时，酵母繁殖量低，混合果酒不能得到充分发酵，因此糖不能被酵母全部吸收转化，从而酒精度低，糖度高。而酵母添加量较高时，添加量越高，酵母的生存竞争力越大，导致酵母存活率越低，最终糖度升高，酒精度降低。当酵母接种量为0.4 g/L时，酵母存活率高，且存活状态旺盛，因此糖利用率较高，糖度较低而酒精度高，结合感官评分，确定酵母接种量0.4 g/L为较优条件。

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面试验结果

优化试验结果见表3。

表3 响应面试验设计方案及结果Table 3 Results of Box-Behnken central composite design

根据Design Expert V8.0.6软件的分析，得到A初始糖度、B焦亚硫酸钠添加量、C酵母接种量对感官评分的回归方程：感官评分=81.4+1.13A-2.75B+0.63C-0.5AB-1.25AC+0.5BC-5.58A2-4.83B2-2.57C2。

2.2.2 方差分析

回归模型的方差分析结果见表4。

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance of regression model

由表 4可知，该模型极显著（P=0.000 2＜0.01），失拟项不显著（P=0.298 4＞0.05），模型的选取具有合理性。决定系数R2=0.968 3，校正系数R2adj=0.927 6，表明此模型可以用于可靠分析混合果酒的发酵工艺。一次项初始糖度差异显著（P＜0.05），焦亚硫酸钠添加量差异极显著（P＜0.01），交互项表现不显著（P＞0.05），二次项 A2、B2、C2差异均为极显著（P＜0.01），表示本试验的因素选择合理。根据F值可判断因素对响应值的影响程度，表4中一次项所对应的F值大小排序为B＞A＞C，表明焦亚硫酸钠添加量影响力最强，酵母接种量影响最弱。

2.2.3 交互作用分析

根据3D响应图中各因素的走势可以推断对响应值的作用大小。响应面曲面中，越平坦的曲面可判定为影响响应值的能力越小，反之亦然。各因素对混合果酒感官评分影响的响应面图见图6。

由图6可知，从曲面的倾斜度可以判断，焦亚硫酸钠添加量的曲面最陡峭，表明对感官评分的影响最大，初始糖度的曲面次之，酵母接种量的曲面最平缓，这与方差分析的结果一致[17]。

图6 各因素对混合果酒感官评分影响的响应面Fig.6 Response surface graph of the effects of different factors on sensory score of mixed fruit wine

2.2.4 混合果酒最佳条件的验证

通过软件分析与优化，最优发酵参数为初始糖度24.21°Brix、焦亚硫酸钠添加量 64.25 mg/L、酵母接种量0.41 g/L，该数据下混合果酒的感官评分为81.875 5分。为了使试验操作更好地进行，修正后的参数值为初始糖度24.2°Brix、焦亚硫酸钠添加量65 mg/L、酵母接种量0.41 g/L，进行3次平行，得出的混合果酒感官评分为83分，与预测的数值十分接近，表示该试验结果可信度较高，也可以更好地预测混合果酒的发酵条件会如何影响感官评分。

2.3 混合果酒的性质分析

2.3.1 混合果酒抗氧化活性分析

混合果酒·OH清除能力见图7。

图7 混合果酒·OH清除率Fig.7 The scacenging ability of·OH of mixed fruit wine

由图7可知，混合果酒的·OH清除率较高，在样品添加量范围内变化幅度较小，VC的·OH清除率在添加量为0.3 mL～1.2 mL之间呈现上升趋势，在添加量高于1.2 mL后，持续保持较高的清除率。在样品添加量0.3 mL～1.2 mL时，混合果酒的清除率高于VC的清除率，当混合果酒的添加量为0.3 mL时，其·OH清除率已经达到98%。样品添加量为1.2 mL～2.0 mL时，混合果酒和VC的清除率都保持较高状态，且VC的清除率略高于混合果酒的清除率[18]。

混合果酒对Fe3+还原力的影响见图8。

图8 混合果酒对Fe3+还原力的影响Fig.8 The effect of fruit wine on Fe3+reducing ability

由图8可知，在样品添加量范围内，混合果酒及VC的Fe3+还原力均随着样品添加量的增加而逐渐增大，最后趋于稳定。由于番茄中存在的番茄红素具有强力的抗氧化特性，且在工艺过程中添加了焦亚硫酸钠（抗氧化剂），与 FeCl3发生反应可以使 K3[Fe（CN）6]的 Fe3+还原为Fe2+。混合果酒在添加量为0.25 mL～1.50 mL时，其Fe3+还原力小于VC的Fe3+还原力，当混合果酒添加量为1.75 mL～2.00 mL时，混合果酒的Fe3+还原力略高于 VC的 Fe3+还原力[19]。

2.3.2 指标分析

由最优工艺进行3组平行验证试验，测定出混合果酒的酒精度 9.6%vol，pH3.5，糖度 7.6 °Brix，透光率73.1%，色度1.303，还原糖54.12 g/L，干浸出物28.4 g/L，感官评分81分。

2.3.3 香气成分分析

混合果酒的主要香气成分见表5。

表5 混合果酒的香气成分Table 5 Aroma components of fruit wine

由表5可知，这些香气成分主要有酯类、醇类、酸类等，其中峰面积占比＞1%的香气物质有异戊醇34.37%（苹果白兰地香气）、硫酸二丁酯16.22%（花香香韵）、辛酸乙酯14.80%（白兰地酒香味）、癸酸乙酯10.08%（果香、酒香、白兰地香味）、苯乙基乙醇4.11%（玫瑰香味）、乙酸异戊酯3.64%（香蕉香气）、甲酸正己酯2.49%（水果香味）、辛酸2.17%（水果香气）、己酸乙酯1.65%（曲香、菠萝香型香气），占峰面积最高的成分为异戊醇34.37%。康明丽等[20]研究柑橘果酒香味物质中，辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯为果酒做出主要贡献，与本试验结果相近。超过800种的香气成分蕴藏在果酒中[21-22]，大多数酯类物质具有花果香味和酒香味，因此赋予了混合果酒的香气。

2.3.4 特征官能团的测定结果

果酒的红外特征光谱图见图9。

图9 果酒的红外光谱图Fig.9 Infrared spectrum of fruit wine

由图9可知，3 297 cm-1处的强宽吸收带为O-H伸缩振动，对应酒中的羧基中的OH；2 917 cm-1为C-H 伸缩振动区（3 000 cm-1～2 700 cm-1）；1 714 cm-1的吸收峰处于羰基C=O的伸缩振动区（1 900 cm-1～1 650 cm-1），可能对应的是混合果酒中的酯类物质；1 605 cm-1的吸收峰位于双键伸缩振动区（1 690 cm-1～1 500 cm-1），可能对应的是混合果酒中含有苯环骨架的物质；1 222 cm-1和1 402 cm-1的吸收峰位于X-H面内弯曲振动及X-Y伸缩振动区（1475cm-1～1000cm-1），1 402 cm-1附近的吸收峰说明混合果酒中含脂肪族-α-氨基酸[23]，1 222 cm-1的吸收峰对应的是酯类的=CO-C基团，对应混合果酒中的酯类物质；1 035 cm-1的强尖峰说明混合果酒中含有伯醇类物质；921 cm-1位于烯烃、芳烃的C-H面外振动区。

3 结论

本文采用单因素、响应面试验，拟定橙子番茄混合果酒发酵工艺，优化后工艺条件为橙子果浆（橙子∶水=1∶2）与番茄果浆（番茄∶水=1∶1）的体积比为 1∶2，初始糖度24.2°Brix，酵母接种量0.41 g/L，焦亚硫酸钠添加量65 mg/L，感官评分为83分。在最优条件下得到的混合果酒色泽呈淡红色，果香与酒香味协调，酸甜适中，回味香甜。混合果酒的·OH清除率可达到98%，Fe3+还原力随着样品的添加量增大而增大。采用气相色谱-质谱联用技术分析混合果酒的挥发性香气物质，主要成分为异戊醇、硫酸二丁酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。混合果酒在红外光谱图中存在较明显的特征峰，这些特征峰与混合果酒所含物质组分相符。