乙醇干扰线虫味觉可塑性相关基因的生物信息学分析*

曹亚伟 李 晋

（周口师范学院生命科学与农学学院 河南周口 466001）

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）属线形动物门、线虫纲。有研究表明，在挥发性的化学引诱剂（例如,乙醇）的作用下，线虫会表现出适应性与食物信号关联的可塑性行为，即味觉可塑性［1］。

乙醇作用于学习和记忆的分子机制目前仍不甚了解。有研究指出，Tph-1基因、Ser-4基因、Ser-7基因通过复合胺信号参与乙醇对线虫味觉可塑性的调控［2］。复合胺信号是一种吲哚衍生物，与人的情绪调节、细胞发育有关。色氨酸羟化酶（TPH）在额叶皮质、杏仁核、海马区等脑区的表达丰富,是复合胺信号的限速酶之一,决定了活体复合胺信号的浓度。既往遗传学研究认为，Tph-1基因能部分导致复合胺信号水平降低及降低抑郁症的发生［3］。也有研究发现，复合胺信号参与调控脑回路的结构及可塑性作用［4］。TPH 是褪黑激素生物合成的第1 个酶，在脊椎动物松果体中表达［5］。Tph-1基因的突变会导致联想学习的缺陷，外源性的复合胺可在一定程度上恢复学习和感觉的缺陷。而且，过量表达的Tph-1可提高线虫的学习及感觉能力［6］。Ser-4基因和Ser-7基因编码G 蛋白偶联受体［7-8］。Ser-4基因在复合胺信号对寿命及产卵行为有重要调控作用［9］。Ser-7基因在复合胺信号中调控组织缺氧增强的感知行为及咽部泵动［10］。目前,对线虫Tph-1、Ser-4、Ser-7基因的研究不多，至今仍未有对上述基因的生物信息学方面研究的报道。

运用生物信息学的方法，对上述基因进行分析，以期为揭示乙醇干预动物神经行为可塑性的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫复合胺信号关键基因生物信息学分析数据来源 NCBI 数据库获取线虫的Tph-1（NC_003280.10）、Ser-4（NC_003281.10）、Ser-7（NC_003284.9）的核酸及氨基酸序列。

1.2 线虫复合胺信号关键基因生物信息学分析工具

使用ExPASy -PortPara （http://web.expasy.org/protparam/）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白质理化性质。

使用ProtScale 软件（http://web.expasy.org/protscale/）对Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白进行亲疏水性预测。

使用SignalP-5.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/）预测Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白信号肽。

使用HMMTOP （http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜结构。

使用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析Tph-1、Ser-4、Ser-7蛋白亚细胞定位。

使用NeTphos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/Services/NeTphos-3.1/）分析预测Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白磷酸化修饰位点。

2 线虫复合胺信号关键基因生物信息学分析

2.1 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白基本理化性质分析

Tph-1 蛋白含有429 个氨基酸，分子质量为49 117.58，等电点为5.76，分子式为C2192H3374-N596O654S18，包括6 834 个原子。正电荷数（Arg+Lys）为49 个，负电荷数（Asp+Glu）为61 个。Tph-1 蛋白半衰期为30 h，不稳定系数为40.47，为不稳定蛋白；脂肪族系数为78.04；总平均亲水性为-0.418，即Tph-1 蛋白为带负电荷的不稳定亲水性蛋白质（图1A）。2 个软件预测一致。

Ser-4 蛋白含有445 个氨基酸，分子质量为50 141.84，等电点为9.41，分子式为C2275H3633-N609O622S21，包括7 160 个原子。正电荷数（Arg+Lys）为53 个，负电荷数（Asp+Glu）为37 个。Ser-4 蛋白半衰期为30 h，不稳定系数为40.93，为不稳定蛋白；脂肪族系数为104.29；总平均亲水性为0.154，即Ser-4 蛋白为带正电荷的不稳定疏水性蛋白质（图1B）。2 个软件预测一致。

Ser-7 蛋白含有410 个氨基酸，分子质量为46 093.54，等电点为9.46，分子式为C2107H3345-N543O563S25，包括6 583 个原子。正电荷数（Arg+Lys）为45 个，负电荷数（Asp+Glu）为27 个。Ser-7 蛋白半衰期为30 h，不稳定系数为36.39，为稳定蛋白；脂肪族系数为107.32；总平均亲水性为0.358，即Ser-7 蛋白为带正电荷的稳定疏水性蛋白质（图1C）。2 个软件预测一致。

图1 蛋白质亲、疏水性分析

2.2 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白信号肽分析

对Tph-1 蛋白、Ser-4 蛋白、Ser-7 蛋白进行信号肽分析，结果表明，3 种蛋白质均无明显信号肽序列。Tph-1 蛋白（图2A）信号肽可能性为0.0006，Ser-4 蛋白（图2B）信号肽可能性为0.0008，Ser-7蛋白（图2C）信号肽可能性为0.004。

图2 蛋白质信号肽分析

2.3 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜区分析

HMMTOP 预测Tph-1 蛋白（图3A）没有跨膜结构。Ser-4 蛋白（图3B）有7 个跨膜区，跨膜螺旋为 ：107 -131aa、144 -168aa、183 -202aa、223 -242aa、269-288aa、424-443aa、460-479aa。Ser-7蛋白（图3C）有7 个跨膜螺旋，跨膜螺旋为：97-121aa、132 -154aa、167 -191aa、212 -234aa、261 -278aa、375-395aa、408-426aa。

图3 HMMTOP 预测蛋白跨膜区分析

2.4 Tph -1、Ser -4、Ser -7蛋白亚细胞定位Cell-PLoc 2.0 预测结果为：Tph-1 蛋白在细胞质表达，Ser-4 蛋白和Ser-7 蛋白在细胞膜表达。

2.5 Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白磷酸化修饰位点预测 对3 种蛋白质进行磷酸化修饰位点预测（表1、图4），磷酸化修饰位点最多的是丝氨酸，最少的是酪氨酸。Ser-4 蛋白磷酸化修饰位点最多，为71个；Ser-7 蛋白磷酸化修饰位点最少，为60 个。丝氨酸磷酸化修饰位点与磷酸化修饰位点总数均为差异非常显著，苏氨酸磷酸化修饰位点为差异显著，酪氨酸差异不显著。

表1 3 种蛋白磷酸化修饰位点预测

3 讨论

研究发现，长期摄入乙醇，导致机体产生乙醇依赖甚至成瘾。其原因为乙醇通过调控神经递质、电压通道及激素受体等靶细胞，影响基因转录、表达和细胞代谢，导致机体对乙醇耐受［11］。有研究发现，酗酒会引起基因改变，影响调控生物钟的period2基因及调节应激系统POMC基因表达降低，导致对乙醇更强的渴望［12］。而且，包括抑郁症、暴食症、强迫症及酒精中毒在内的行为障碍均与复合胺信号的缺陷有关［13］，即人类的行为障碍疾病可能与Tph-1、Ser-4、Ser-7基因有关。

本文生物信息学结果显示，Tph-1 蛋白含有429 个氨基酸，等电点为5.76，半衰期为30 h，为不稳定且亲水性蛋白质。Ser-4 蛋白含有445 个氨基酸，等电点为9.41，半衰期为30 h，为不稳定且疏水性蛋白质。Ser-7 蛋白含有410 个氨基酸，等电点为9.46，半衰期为30 h，为稳定且疏水性蛋白质。

Ser-4、Ser-7 蛋白跨膜区分析结果与山羊、京海黄鸡［14-15］等物种的G 蛋白结构相似，均为7 次跨膜结构。蛋白质磷酸化分析结果表明，Tph-1、Ser-4、Ser-7 蛋白都是功能活跃的跨膜蛋白。因为3 种蛋白没有信号肽，可知不是分泌蛋白。而是由游离核糖体合成，转移到细胞质或细胞膜表达。

本研究结果有利于Tph-1、Ser-4、Ser-7基因的后续研究分析，为以后研究乙醇调控线虫味觉可塑性的分子机理提供理论依据。

4 结论

结果表示，Tph-1 蛋白含有429 个氨基酸，等电点为5.76，为不稳定且亲水性蛋白质，没有明显的信号肽序列及跨膜螺旋，且在细胞质表达，有62 个磷酸化修饰位点。Ser-4 蛋白含有445 个氨基酸，等电点为9.41，为不稳定且疏水性蛋白质，无明显的信号肽序列，含有7 个跨膜螺旋，且在细胞膜表达，有71 个磷酸化修饰位点。Ser-7 蛋白含有410 个氨基酸，等电点为9.46，为稳定且疏水性蛋白质，无明显的信号肽序列，含有7 个跨膜螺旋，且在细胞膜表达，有60 个磷酸化修饰位点。