Erk1/2 和 Akt 介导白藜芦醇抗 IPEC-J2 细胞氧化的应激凋亡

刘明明，徐兆云，巩宇红，金鑫鑫，袁渤雨，王 玮，5*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.中国人民武装警察部队特种警察学院，北京 100000； 3.南方医科大学 南方医院实验动物研究中心，广东 广州 510515； 4.吉林大学 基础医学学院，吉林 长春 130021； 5.仲恺农业工程学院 动物科学学院，广东 广州 510225)

氧化应激严重影响养殖业发展。如果活性氧(ROS)浓度的增加远远超过细胞的抗氧化能力，则该生物将处于氧化应激状态。细胞处于氧化应激状态时，将会出现DNA序列片段化，细胞皱缩和细胞核固缩等情况[1-2]，从而引起细胞蛋白表达异常，脂质和DNA损伤，细胞功能障碍和细胞凋亡，最终表现出多种疾病发生[3]。肠上皮细胞(IEC)凋亡和增殖之间的平衡对于维持肠屏障功能至关重要。过度的ROS诱导的IEC氧化应激导致肠毒素渗透增加和过敏原渗透增加，最终引发炎症级联反应和一系列组织损伤。过氧化氢是ROS的主要分子，调节氧化应激[4]。过氧化氢为有毒的副产物，已被证明可以破坏肠黏膜，引起氧化应激损伤并影响胃肠道屏障功能[5-6]。利用天然抗氧化剂缓解和保护氧化应激损伤具有重要意义。

目前的研究表明白藜芦醇具有抗氧化特性，已被应用于多种病毒引发的疾病的治疗之中，主要用于抵抗氧化损伤，例如肥胖哮喘[7]，妊娠糖尿病[8]，血管衰老[9]和动脉粥样硬化[10]，几乎没有不良副作用。目前，关于白藜芦醇对猪肠道上皮细胞的保护作用研究很少。以前的研究表明，在IPEC-J2细胞中，白藜芦醇处理后Erk和Akt通路被激活。本研究旨在探究Erk和Akt通路在白藜芦醇对细胞凋亡的保护中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系和细胞培养猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)是一种非转化的肠细胞系，最初来源于新生仔猪的空肠上皮[11]。细胞在添加10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基中生长。

1.2 细胞模型与分组根据先前的研究，过氧化氢和白藜芦醇的最佳浓度为50 μmol/L。本研究将IPEC-J2细胞分为4组。过氧化氢组用50 μmol/L过氧化氢处理24 h。对照组用含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养。白藜芦醇预处理组(白藜芦醇+过氧化氢组)用50 μmol/L白藜芦醇预保护1 h后，用 50 μmol/L过氧化氢处理24 h。抑制剂组用U0126/MK2206处理2 h后，暴露于50 μmol/L白藜芦醇+过氧化氢中24 h。为了确保氧化应激效率，每次试验前用30%的新原液制备过氧化氢。

1.3 蛋白免疫印迹收集处理过的细胞并按照标准方案进行蛋白免疫印迹检测[11]。

1.4 细胞内 ROS 测定将细胞接种在96孔板中，给药作用24 h后使用DCFH-DA探针检测荧光强度。

1.5 DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色分析细胞凋亡培养IPEC-J2细胞，将其与50 μmol/L过氧化氢孵育24 h，固定细胞并将其置于DAPI溶液中，并在黑暗中孵育1 min，结束后观察细胞。

1.6 DNA 片段测定将细胞接种到 6 孔板中(0.5×106～1×106/孔)，37℃ 下孵育过夜。用化合物处理 12 h后， 按照说明书使用 OMEGA Tissue DNA Kit 提取 DNA。将从含有 0.5%胎牛血清的 D-MEM/F-12 处理 12 h的细胞中所提取的 DNA 用作阳性对照。15 μL DNA 提取物在 80 V 下进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳 1 h。

2 结果

2.1 白藜芦醇抑制过氧化氢所诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡凋亡小体是细胞凋亡的标志。DAPI 染色结果显示，25，50 μmol/L 白藜芦醇对 IPEC-J2细胞具有保护作用(图 1 E，F)，白藜芦醇显著抑制过氧化氢诱导的核固缩和凋亡小体的形成。通过流式细胞仪评估细胞凋亡率(图 1 G)，结果表明，过氧化氢处理组细胞凋亡百分比(21.13±2.62)%，对照组细胞凋亡百分比(2.88±0.60)%，过氧化氢处理组细胞凋亡百分比明显高于对照组(P<0.05)，白藜芦醇预处理后的 IPEC-J2 细胞显著抑制过氧化氢所诱导的细胞凋亡(4.77±0.50)%。因此，白藜芦醇可以抑制过氧化氢所诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡。

A.对照细胞;B.50 μmol/L 过氧化氢处理组;C～F.不同浓度(5，10，25，50 μmol/L)的白藜芦醇预处理 1 h，然后 50 μmol/L 过氧化氢刺激 24 h,红色箭头所指为细胞核中的凋亡小体;G.使用FITC标记的 Annexin V/PI 染色的流式细胞术分析细胞凋亡(n=3)。**表示与对照组相比P<0.01，## 表示与 50 μmol/L 白藜芦醇预处理组相比P<0.01图1 DAPI 荧光染色分析和流式细胞术检测白藜芦醇对过氧化氢诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡的影响

2.2 白藜芦醇降低 IPEC-J2 细胞中过氧化氢所诱导的 ROS 产生和凋亡相关蛋白表达氧化应激状态导致细胞中的ROS增加。为了研究白藜芦醇是否降低了过氧化氢所诱导的 IPEC-J2 细胞的氧化应激水平，使用荧光探针 DCFH-DA 活性氧检测试剂盒测量 ROS 的产生。结果表明，与对照组相比，过氧化氢组细胞内 ROS 产生明显增加(P<0.01)， 而 50 μmol/L 白藜芦醇预处理组可完全逆转过氧化氢所诱导的 ROS 产生(P<0.01)(图 2A)。

A.使用荧光探针 DCFH-DA 活性氧检测试剂盒检测活性氧的水平;B～F.在不同浓度的白藜芦醇存在下，通过蛋白质印迹法(n=3)评估每组中 Bcl-2、Bax、BAD 和 Caspase-3 的蛋白表达。与对照组组比较*P<0.05，**P<0.01；与过氧化氢组比较#P<0.05，## P<0.01图2 白藜芦醇对 IPEC-J2 细胞中过氧化氢所诱导的 ROS 产生和凋亡相关蛋白表达的影响

由于以上试验得出白藜芦醇具有抑制作用，因此接下来将研究其与内源性过程中凋亡相关蛋白之间的相互作用。通过 Western blot 检测 Bcl-2/Bax 比值的变化，白藜芦醇预处理或不预处理后 Bad 和 Caspase-3 的表达水平。结果表明，过氧化氢显著降低了 Bcl-2/Bax 比值，增加了 BAD、Caspase-3 的表达量。但是，白藜芦醇增加了抗凋亡的 Bcl-2/Bax的比例，降低了由过氧化氢所诱导的促凋亡蛋白 BAD 和 Caspase-3 的表达水平。结果证明，白藜芦醇通过内源性凋亡途径抑制细胞凋亡。

2.3 对 Akt 和 Erk 通路的阻滞减弱了白藜芦醇对 IPEC-J2 细胞的保护作用已有研究表明 IPEC-J2 细胞的 Erk1/2 和 Akt 途径可以被白藜芦醇激活。因此接下来研究白藜芦醇是否通过这两个途径发挥其抗凋亡作用。使用 Erk1/2 或 Akt 的特异性抑制剂 U0126 或 MK2206(10 μmol/L)预处理细胞 2 h后进行试验。DAPI 染色显示抑制剂处理后，显著降低了白藜芦醇对过氧化氢所诱导的 IPEC-J2 细胞的保护作用。DNA 片段化是凋亡的典型特征，用琼脂糖凝胶电泳检测不同条件下细胞内的 DNA 样品。如图 3F 所示， DNA 阶梯分析表明，与对照组(a)相比，过氧化氢增加了 DNA 片段化(b)，而过氧化氢诱导的 DNA 片段化在白藜芦醇预处理(c)后减弱，U0126(d)和 MK2206(e)预处理后抵消了白藜芦醇对过氧化氢诱导的 DNA 片段化的保护作用。结果表明,白藜芦醇通过 Akt 和 Erk1/2 通路发挥抗凋亡作用。

2.4 Akt 和 Erk1/2 通路抑制剂减弱了白藜芦醇对过氧化氢所诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡相关蛋白表达的影响为了研究白藜芦醇诱导的线粒体凋亡蛋白表达与 Akt 和 Erk1/2 通路活化之间的关 系，采用蛋白质印迹法检测有无抑制剂存在时 Bcl-2/Bax 比值。结果表明，白藜芦醇在过氧化氢处理下显著提高了 Bcl-2/Bax 的比值(图 4)。同样，U0126(图 4A，C)或 MK2206(图 4B，D)预处理后消除了白藜芦醇的保护作用。结果表明，白藜芦醇通过 Akt 和 Erk1/2 信号通路保护过氧化氢诱导的细胞凋亡。

A.对照组细胞；B.50 μmol/L 过氧化氢处理 组;C.50 μmol/L 白藜芦醇预处理 1 h后，50 μmol/L 过氧化氢刺激的 IPEC-J2 细胞处理 24 h;D,E.使用 10 μmol/L MK2206和 U0126预处理 2 h,然后用 50 μmol/L 白藜芦醇处理细胞 1 h，最后加入 50 μmol/L 过氧化氢刺激 IPEC-J2 细胞 24 h;F.对 IPEC-J2 细胞基因组 DNA 进行不同处理的琼脂糖凝胶电泳分析;(M.DNA Marker；a.对照组；b.50 μmol/L过氧化氢处理组；c.50 μmol/L白藜芦醇+50 μmol/L 过氧化氢处理组；d.10 μmol/L U0126+50 μmol/L白藜芦醇+50 μmol/L 过氧化氢；e.10 μmol/L MK2206+50 μmol/L 白藜芦醇+50 μmol/L 过氧化氢)图3 白藜芦醇对过氧化氢诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡小体形成和 DNA 断裂的影响，通过 DAPI 荧光染色分析和 DNA 梯状琼 脂糖凝胶电泳检测到 Erk1/2 或 Akt 通路的特异性阻断

3 讨论

IPEC-J2 是猪的空肠上皮细胞系，广泛用于猪的肠道通透性和炎症研究，但关于白藜芦醇与 IPEC-J2 细胞凋亡之间的研究甚少，具体机制尚不清楚。

氧化应激在许多疾病过程中起着重要作用，这些疾病可引起胃肠道吸收不良和炎症反应， 例如腹泻[12-13]、坏死性小肠结肠炎和 IBD[14]。氧化应激的主要原因是 ROS 的过量产生，但是导致细胞凋亡的潜在机制很复杂，涉及多种细胞成分、受体、信号转导途径的激活和功能障碍以及 DNA 损伤。ROS 作为主要自由基分子，过氧化氢可以直接导致 ROS的过量产生并诱导许多细胞凋亡。大量研究表明，过氧化氢可在许多细胞类型中诱导氧化应激，例如鼠心肌细胞系 H9C2[15]、人脐静脉内皮细胞[16]、人肝上皮细胞[17]和人晶状体上皮细胞[18]。因此，通过增加抗氧化剂酶水平或使用抗氧化剂抑制 ROS 产生或增加 ROS 清除是减少细胞损伤的有效措施[19]。

A,C.U0126抑制机组；B,C.MK2206抑制机组。* P<0.05，**P<0.01图4 白藜芦醇在 Erk1/2 或 Akt 通路特异性阻断后对过氧化氢诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的影响

白藜芦醇作为一种天然多酚，可以有效清除自由基并发挥抗氧化作用[20]。它也作用于人体中的抗衰老酶，进而在预防各种与年龄有关的疾病和延长预期寿命中发挥潜在作用[21-22]。

本研究以 IPEC-J2 细胞为基础，使用过氧化氢建立氧化应激诱导的细胞凋亡模型。通过白藜芦醇预处理来研究白藜芦醇对过氧化氢诱导的IPEC-J2 细胞凋亡的影响。根据我们以前的研究，我们确定了过氧化氢和白藜芦醇的最佳工作浓度。细胞内 ROS 的测定结果表明50 μmol/L 白藜芦醇可以减少由过氧化氢诱导的 ROS 的过量产生。DAPI 荧光染色的结果表明50 μmol/L 的过氧化氢可使细胞核固缩，染色质积聚并产生凋亡，而50 μmol/L 的白藜芦醇可明显逆转这种现象。此外，白藜芦醇可以显著逆转过氧化氢诱导的 Bcl-2/Bax 比值降低和促凋亡蛋白 BAD 的表达增加。这些试验结果充分证明了天然多酚化合物白藜芦醇可以保护猪的空肠上皮细胞免受氧化应激损伤，也为研究和治疗人畜氧化应激相关疾病提供了理论基础。

进一步的试验结果表明，白藜芦醇对 IPEC-J2 细胞的保护作用与 Erk1/2 和 Akt 通路密切相关。大量研究表明，白藜芦醇可以有效减少多种刺激引起的 ROS 的产生，抑制炎症的发展，并促进多种抗氧化酶在细胞中的表达[23-24]。其中，NF-κB 是 ROS 敏感的转录因子之一，在氧化应激和炎症反应中起着重要作用，并在抗炎、促进细胞生长和白藜芦醇的抗癌作用中发挥重要作用[25]。而 MAPKs 家族，包括 JNK1/2、P38/MAPK 和 Erk1/2，是 ROS 的另一个敏感调节因子[26]。白藜芦醇可以通过减少 Erk1/2 磷酸化和 NF-κB 活性来减轻大鼠氧化应激引起的颈动脉球囊损伤[27]。白藜芦醇可以通过减弱人血管内皮细胞中的 P38/MAPK 磷酸化来抑制高血糖[27]。白藜芦醇可以通过激活 Akt 通路改善 2 型糖尿病患者的胰岛素抵抗并降低氧化应激[28]。研究表明，白藜芦醇可以通过减少抗氧化酶 SOD、过氧化氢酶和 HO-1 的表达来抑制过氧化氢诱导的人晶状体上皮 B-3 细胞的氧化损伤[29]。同样，Sirt1 在氧化应激反应中也起重要作用。白藜芦醇通过激活 NAD+依赖性蛋白脱乙酰基酶 Sirt1 来实现其抗氧化作用。反过来，Sirt1 通过诱导线粒体 SOD 发挥细胞内抗氧化作用[30]。在成骨细胞中，过氧化氢可以增加 Bax 和 Caspase-9 的表达以及 P53 的磷酸化，同时下调 Sirt1 的表达。尽管如此，白藜芦醇可以通过增加 Sirt1 表达来抑制过氧化氢诱导的成骨细胞凋亡[31]。 总之，白藜芦醇通过多种信号途径显示了不同细胞类型中氧化损伤和细胞凋亡的保护作用。 在这项研究中，我们表明Erk1/2和Akt的抑制剂U0126和MK2206减弱了白藜芦醇对IPEC-J2细胞凋亡的保护作用。这证明白藜芦醇通过Akt和Erk1/2途径在猪肠上皮细胞 中发挥其保护作用。

综上所述，本研究的结果提供了初步证据，表明白藜芦醇通过减少氧化损伤，维持正常细胞形态和抑制细胞凋亡对 IPEC-J2 具有起到保护作用。此外，白藜芦醇作用的发挥可能与 Akt 和 Erk1/2 信号通路相关。这些数据共同证明白藜芦醇可作为维持仔猪肠道健康和屏障完整性的天然化合物的候选者。